曹志華，羅靜波

（長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025）

植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶，主要存在于細(xì)菌和部分真菌中。在植物中，特別是谷物、麥類作物種子，植物植酸酶是其天然成分。研究表明［1－4］，小麥中植酸酶活性雖不如某些微生物中提取的植酸酶活性強(qiáng)，但其添加效果與飼料中添加無機(jī)磷的效果相當(dāng)。植物中的植酸酶活性受溫度、p H、植物種子的種類等多種因素的影響［5－6］。本研究采用發(fā)芽和發(fā)酵對(duì)原料進(jìn)行處理后，通過測(cè)定小麥種子植酸酶的活性，探討了飼料原料的加工處理對(duì)磷的存在形式的影響，以為提高動(dòng)物對(duì)磷的有效利用做些基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用小麥品種為西農(nóng)97、東農(nóng)123、東農(nóng)97382，由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，3個(gè)品種分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。酵母菌為安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn)

將3種小麥的種子，浸泡2d后，分別放入墊有濾紙的54個(gè)培養(yǎng)皿中，種子厚度不超過1c m，置于25℃恒溫箱中發(fā)芽0～6d，期間，每隔24h取出發(fā)芽的種子，于室溫下用吹風(fēng)機(jī)吹干后于4℃低溫保存，用于植酸酶活性的測(cè)定。試驗(yàn)分為3組，每組6個(gè)培養(yǎng)皿，3次重復(fù)。

1.2.2 發(fā)酵試驗(yàn)

將小麥粉碎，過60目篩，取400g，加入安琪酵母4g，混合均勻，用100 ml的燒杯18個(gè)，每個(gè)加入準(zhǔn)備好樣本20g，并按1︰1的比例加入蒸餾水，在溫度為30℃的恒溫箱中發(fā)酵0～6d，每24h取樣，取出的樣本在50℃烘箱中烘3h，并在常溫下風(fēng)干，檢測(cè)植酸酶的活性。

1.3 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將化學(xué)純的KH2PO4在105℃烘箱烘2h后于干燥器中冷卻至室溫，準(zhǔn)確稱取612.4 mg，用三重蒸餾水溶解，定容至500 ml，配成9.0 mmo1／L磷酸鹽貯存液。用該溶液按表1稀釋成磷標(biāo)準(zhǔn)液。

以微量取樣器吸取3.000 ml植酸鈉溶液，分別注入8只已編號(hào)的10 ml離心管中，于第1只加入1.000 ml三重蒸餾水，其余7只依次加入1.000 ml不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)液，置于37水浴鍋中1h，分別加入4.000 ml釩鉬酸銨顯色／終止液，混勻后靜置20 min，在分光光度計(jì)415 mn波長(zhǎng)處以蒸餾水做空白對(duì)照測(cè)光密度，建立光密度—磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］。

表1 磷的標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.4 植酸酶酶粗液的提取及活性測(cè)定

樣品粉碎后過60目篩。稱取2.0g粉碎樣品，放入100 m1燒杯中，加入50 m1濃度為0.25 ml／L，p H5.50的冷卻乙酸緩沖液，用磁力攪拌器攪動(dòng)60 min，使酶蛋白充分溶出，制成懸浮液，用濾紙過濾，定容至100 ml，得植酸酶粗酶溶液。

取l0 ml離心管4只，加入3 m1三重蒸餾水，1只作空白對(duì)照，其他3只分別加入3 m1植酸鈉溶液，置于37℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，以相同間隔依次在反應(yīng)管中加入1 m1提取出的植酸酶溶液，在37℃水浴鍋中溫育1h，按與加入酶液相同的順序和時(shí)間間隔加入4 m1釩鉬酸銨顯色／終止液，混合搖勻，3000r／min離心15 min。在分光光度計(jì)于415n m波長(zhǎng)處以空白管作對(duì)照測(cè)定光密度。植酸酶活性的計(jì)算如下：

植酸酶活性（U／kg）＝C×100／60m

式中，C為分光光度計(jì)上讀取的光密度值；m 為樣品重量（g）；100為稀釋倍數(shù)，60為反應(yīng)時(shí)間（min）；

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SAS 6.12軟件包一般線性模型（GL M）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽對(duì)植酸酶活性的影響

由圖1可知，3個(gè)小麥品種植酸酶活性在發(fā)芽3d后達(dá)到最大，分別為2120、2350、2890 U／kg。第3～6天酶的活性保持在高位，但相互之間沒有顯著差異。但與沒有發(fā)芽和發(fā)芽1～2d的試驗(yàn)組相比，差異極顯著。

圖1 發(fā)芽不同時(shí)間后小麥的植酸酶活性

3.2 發(fā)酵對(duì)植酸酶活性的影響

由圖2可見，與沒有發(fā)酵的種子相比，發(fā)酵明顯提高了植酸酶的活性，而且差異極顯著。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，第3和第4天植酸酶活性達(dá)到最大，之后保持在比較高的水平。

圖2 發(fā)酵不同時(shí)間后小麥的植酸酶活性

3 討論

植物種子在干燥狀態(tài)下，植酸酶的活性處于鈍化狀態(tài)。當(dāng)發(fā)芽時(shí)，植酸酶被激活，水解植酸磷，供作物生長(zhǎng)。因此發(fā)芽是提高種子植酸酶活性的有效方法。小麥種子植酸酶的活性隨發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，其活性明顯增加。本研究結(jié)果顯示，第1天為860 U／kg，第2天為2100 U／kg，達(dá)到最高。相對(duì)沒有發(fā)芽的種子，發(fā)芽可以增加活性4倍左右。也有研究顯示，小麥發(fā)芽后，植酸酶的最高活性可以增加8倍左右［4］。這可能與發(fā)芽溫度和小麥的品種不同有關(guān)［6］。其他植物種子中植酸酶的活性也有相同的趨勢(shì)，如大豆發(fā)芽第5天，植酸酶活性提高2.27倍；萵苣發(fā)芽3d，植酸酶活性增加6倍。植物種子的發(fā)芽，會(huì)活化很多的酶類，比如蛋白酶、淀粉酶等，分解種子中儲(chǔ)存的養(yǎng)分，使種子干物質(zhì)的損失很大。種子發(fā)芽到植酸酶最高時(shí)，應(yīng)迅速終止發(fā)芽，降低水分含量，同時(shí)保持害植酸酶的活性。

發(fā)酵也是提高小麥種子植酸酶活性的有效途徑。發(fā)酵能提高飼料中各種酶活性［7］，但有關(guān)發(fā)酵對(duì)植酸酶活性的影響現(xiàn)有的研究不多。由于發(fā)酵液中存在一定的無機(jī)磷，影響結(jié)果的測(cè)定［8］，為了減少其干擾，本研究測(cè)定時(shí)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了稀釋，盡量減少影響。本研究在30℃的溫度下，發(fā)酵延續(xù)到第6天，結(jié)果表明，發(fā)酵能提高植酸酶活性，在發(fā)酵后第3天，植酸酶活性最高，比沒有發(fā)酵的小麥種子提高3.2倍。而隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，植酸酶的活性沒有再增加，保持在比較高的水平。發(fā)酵是飼料中微生物活動(dòng)的結(jié)果，能導(dǎo)致溫度大幅升高，同時(shí)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)因酶活性增加而消耗，所以探討合適的發(fā)酵時(shí)間，提高酶活性［9］，同時(shí)又保留種子中的營(yíng)養(yǎng)成分是值得研究的。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵持續(xù)到第3天時(shí)，植酸酶的活性已達(dá)最大。

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