秦璽 ，程龍，饒春明，高凱，楊琦，史新昌，徐小潔，葉棋濃，王軍志

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院 生物制品檢定所，北京1 000502；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

轉(zhuǎn)錄因子c-Myb 由原癌基因c-Myb編碼，分別由DNA結(jié)合區(qū)（DNA binding domain，DBD）、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（central transactivation domain，TAD）、負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)（negative regulatory domain，NRD）和亮氨酸拉鏈構(gòu)成，是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的蛋白[1]，與白血病、結(jié)直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2-4]。c-Myb 促進(jìn)細(xì)胞的增殖，主要通過調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)自身功能。c-Myc是c-Myb 的靶基因，c-Myb 能夠結(jié)合到c-Myc基因啟動(dòng)子的2個(gè)區(qū)域，調(diào)節(jié)c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[5-8]。c-Myc 在20%的腫瘤患者中處于活化狀態(tài)，c-Myc 表達(dá)的增強(qiáng)，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞惡變，最后導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。臨床標(biāo)本中c-Myb 的表達(dá)與c-Myc 的表達(dá)呈正相關(guān)性，但c-Myb 各結(jié)構(gòu)域?qū)-Myc 的調(diào)節(jié)及作用機(jī)制還不清楚。為了進(jìn)一步明確c-Myb 各結(jié)構(gòu)域?qū)-Myc 的調(diào)節(jié)，我們構(gòu)建了c-Myb 不同結(jié)構(gòu)域的截短突變體，分別命名為c-Myb-1、c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-4、c-Myb-5和c-Myb-6，并在乳腺癌細(xì)胞中檢測(cè)了這些突變體對(duì)c-Myc 表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步研究c-Myb各結(jié)構(gòu)域的功能及其在腫瘤中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293T、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、真核表達(dá)載體pcDNA3.0-FLAG、c-Myb野生型質(zhì)粒pcDNA3.0-FLAG-Myb、c-Myc由本室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、細(xì)胞裂解液購(gòu)自天根生化科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ，DNA 連接酶，高保真Taq酶試劑盒購(gòu)自NEB 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR 回收試劑盒購(gòu)自Promega 公司；c-Myc 抗 體、HRP-FLAG 抗體和GAPDH 抗體購(gòu)自Sigma 公 司；SDS-PAGE 膠 和PVDF 轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen 公司；PCR 引物（表1）合成和DNA 測(cè)序由北京奧科鼎盛生物公司完成。

1.2 c-Myb截短突變體的構(gòu)建

以野生型c-Myb為模板，分別進(jìn)行重組PCR 擴(kuò)增，膠回收PCR 產(chǎn)物；用KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR 產(chǎn)物和空載體pcDNA3.0-FLAG，膠回收酶切產(chǎn)物，16℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布含氨芐西林的LB 平板，37℃過夜生長(zhǎng)；挑取平板上的克隆做菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒后用KpnⅠ和XhoⅠ酶切鑒定。

1.3 Western印跡

轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液及SDS-PAGE 加樣緩沖液，煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，上清液進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用一抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次7 min，將含辣根過氧化物酶的ECL底物滴于膜上反應(yīng)5 min，吸干后用X線膠片顯影。

表1 PCR引物及序列

2 結(jié)果

2.1 c-Myb 截短突變體表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

野生型c-Myb結(jié)構(gòu)域如圖1所示[14]。其中，DBD分為R1、R2和R3 區(qū)，均起到與DNA 結(jié)合的作用。用引物Y1和Y2 擴(kuò)增c-Myb 的DBD和TAD 區(qū)基因，即為c-Myb-1基因序列，長(zhǎng)度為978 bp；用引物Y1和Y3擴(kuò)增c-Myb 的DBD 區(qū)基因，用引物Y4和Y5擴(kuò)增c-Myb 的NRD 區(qū)前段基因，用引物Y1和Y5 重組PCR 將c-Myb 的DBD和NRD 前段基因擴(kuò)增到一起，即為c-Myb-2基因序列，長(zhǎng)度為833 bp；用引物Y1和Y3擴(kuò)增c-Myb 的DBD 區(qū)基因，用引物Y6和Y7擴(kuò)增c-Myb 的NRD 區(qū)后段基因，用引物Y1和Y7 重組PCR 將c-Myb 的DBD和NRD 區(qū)后段基因擴(kuò)增到一起，即為c-Myb-3基因序列，長(zhǎng)度為1160 bp；用引物Y1和Y5 擴(kuò)增c-Myb 的DBD、TAD和NRD 區(qū)的前段基因，即為c-Myb-4基因序列，長(zhǎng)度為1230 bp；用引物Y1和Y2 擴(kuò)增c-Myb 的DBD和TAD 區(qū)基因，用引物Y6和Y7 擴(kuò)增c-Myb 的NRD 區(qū)后段基因，用引物Y1和Y7 重組PCR 將這2 段基因擴(kuò)增到一起，即為c-Myb-5基因序列，長(zhǎng)度為1556 bp；用引物Y1和Y3 擴(kuò)增c-Myb 的DBD 區(qū)基因，用引物Y4和Y7 擴(kuò)增c-Myb 的NRD 區(qū)基因，用引物Y1和Y7 重組PCR 將c-Myb 的DBD和NRD 區(qū)基因擴(kuò)增到一起，即為c-Myb-6基因序列，長(zhǎng)度為1526 bp。將上述6 段PCR擴(kuò)增片段與pcDNA3.0-FLAG 分別酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆PCR鑒定，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果c-Myb-1～c-Myb-6酶切條帶均在預(yù)期大小位置出現(xiàn)（圖2）。將酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致，說明c-Myb各突變體構(gòu)建成功。

圖1 c-Myb野生型和截短突變體結(jié)構(gòu)圖

2.2 c-Myb突變體的表達(dá)鑒定

將c-Myb的各截短突變體陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-FLAG 空載體，陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-FLAG-Myb，48 h 后收集細(xì)胞，裂解后用HRP-FLAG 抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，用GAPDH 抗體檢測(cè)內(nèi)參。結(jié)果顯示，野生型c-Myb和各截短突變體在膜上相應(yīng)位置均檢測(cè)到明顯條帶，表明各c-Myb突變體均可表達(dá)（圖3）。

2.3 c-Myb 各突變體對(duì)c-Myb 下游靶基因c-Myc 表達(dá)的影響

用野生型c-Myb和c-Myb 各突變體分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，6 h后換液，在37℃培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，裂解后做Western 印跡，結(jié)果見圖4。相比于野生型c-Myb，含有TAD 區(qū)的突變體c-Myb-1、c-Myb-4、c-Myb-5 都能夠促進(jìn)c-Myc 的表達(dá)，而不含TAD 區(qū)的突變體c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-6 則對(duì)c-Myc 沒有促進(jìn)作用。說明c-Myb 對(duì)c-Myc 的調(diào)控發(fā)生在c-Myb 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，而DNA 結(jié)合區(qū)和負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)則沒有對(duì)c-Myc的調(diào)控作用。

圖2 c-Myb各突變體重組質(zhì)粒的KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測(cè)c-Myb及各突變體在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

圖4 Western印跡檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中c-Myb及c-Myb各突變體對(duì)內(nèi)源c-Myc表達(dá)的影響

3 討論

c-Myb 包含DBD、TAD、NRD 等3 個(gè)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)亮氨酸拉鏈，在本研究中，我們構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)域的截短突變體，突變體均以DBD 為基礎(chǔ)，加上TAD或NRD，并在乳腺癌細(xì)胞中檢測(cè)了上述突變體對(duì)c-Myb 下游基因c-Myc表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的突變體均能上調(diào)c-Myc 的表達(dá)，說明c-Myb 對(duì)c-Myc 表達(dá)的促進(jìn)作用依靠c-Myb 的TAD 區(qū)來執(zhí)行。c-Myb 對(duì)其他下游靶基因的調(diào)節(jié)是否也依賴于TAD結(jié)構(gòu)域，還須實(shí)驗(yàn)來證明。

c-Myb 在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在所有雌激素受體（ER）陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中，c-Myb 均高表達(dá)[15-16]，c-Myb 是雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖所必需的，在對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞分化中，c-Myb 的表達(dá)被下調(diào)，顯示了c-Myb 下調(diào)增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的分化和凋亡[17]。ERα和c-Myb 在乳腺癌細(xì)胞中的異常表達(dá)和相互作用，提示c-Myb 參與了雌激素誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、演變等諸多過程[18]。本研究以乳腺癌細(xì)胞為模型，證明c-Myb 的TAD 結(jié)構(gòu)域能夠升高乳腺癌細(xì)胞中c-Myc 的表達(dá)，由于ERα也能夠促進(jìn)c-Myc 的表達(dá)，因此，c-Myb 對(duì)c-Myc 的調(diào)控是否需要ERα的參與，以及c-Myb 直接調(diào)控還是通過ERα間接調(diào)控c-Myc，還須進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

構(gòu)建c-Myb 不同結(jié)構(gòu)域的突變體，深入探討c-Myb 不同結(jié)構(gòu)域的功能，有利于研究c-Myb 在惡性腫瘤中發(fā)揮功能的分子機(jī)制，能夠更明確c-Myb 作為成藥靶點(diǎn)的區(qū)域和調(diào)節(jié)作用，對(duì)于研發(fā)特異性高，毒性低的抗腫瘤靶向新藥具有重要意義。

[1]Kobe B,Deisenhofer J.Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor,a protein with leucine-rich repeats[J].Nature,1993,366(6457):751-756.

[2]Weinstein Y,Ihle J N,Lavu S,et al.Truncation of the cmyb gene by a retroviral integration in an interleukin 3-dependent myeloid leukemia cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(14):5010-5014.

[3]Thompson M A,Ramsay R G.Myb:an old oncoprotein with new roles[J].Bioessays,1995,17(4):341-350.

[4]Schomburg C,Schuehly W,Da Costa F B,et al.Natural sesquiterpene lactones as inhibitors of Myb-dependent gene expression:structure-activity relationships[J].Eur J Med Chem,2013,63:313-320.

[5]Bechard M,Dalton S.Subcellular localization of glycogen synthase kinase 3 beta controls embryonic stem cell self-renewal[J].Mol Cell Biol,2009,29(8):2092-2104.

[6]Minghetti P P,Norman A W.1,25(OH)2-vitamin D3 receptors:gene regulation and genetic circuitry[J].FASEB J,1988,2(15):3043-3053.

[7]陳蕊,張瑩,趙麗.c-Myc 與c-myb 基因在白血病中的研究進(jìn)展[J].腫瘤防治研究,2011,38(10):1207-1210.

[8]Wang M,Wei X,Shi L,et al.Integrative genomic analyses of the histamine H1 receptor and its role in cancer prediction[J].Int J Mol Med.2014,33(4):1019-1026.

[9]Nesbit C E,Tersak J M,Prochownik E V.MYC oncogenes and human neoplastic disease[J].Oncogene,1999,18(19):3004-3016.

[10]Li Z,Van Calcar S,Qu C,et al.A global transcriptional regulatory role for c-Myc in Burkitt's lymphoma cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(14):8164-8169.

[11]Wilson A,Murphy M J,Oskarsson T,et al.c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation[J].Genes Dev,2004,18(22):2747-2763.

[12]Hock H,Hamblen M J,Rooke H M,et al.Gfi-1 restricts proliferation and preserves functional integrity of haematopoiet-ic stem cells[J].Nature,2004,431(7011):1002-1007.

[13]Guo Y,Niu C,Breslin P,et al.c-Myc-mediated control of cell fate in megakaryocyte-erythrocyte progenitors[J].Blood,2009,114(10):2097-2106.

[14]Greig K T,Carotta S,Nutt S L.Critical roles for c-Myb in hematopoietic progenitor cells[J].Semin Immunol,2008,20(4):247-256.

[15]Cesi V,Casciati A,Sesti F,et al.TGFβ-induced c-Myb affects the expression of EMT-associated genes and promotes invasion of ER+breast cancer cells[J].Cell Cycle,2011,10(23):4149-4161.

[16]Mitra P,Pereira L A,Drabsch Y,et al.Estrogen receptor-α recruits P-TEFb to overcome transcriptional pausing in intron 1 of the MYB gene[J].Nucleic Acids Res,2012,40(13):5988-6000.

[17]Drabsch Y,Robert R G,Gonda T J.MYB suppresses differentiation and apoptosis of human breast cancer cells[J].Breast Cancer Res,2010,12(4):R55.

[18]Edavana V K,Penney R B,Yao-Borengasser A,et al.Fulvestrant up regulates UGT1A4 and MRPs through ERα and c-Myb pathways:a possible primary drug disposition mechanism[J].Springerplus,2013,2:620.