李章華 ，趙強(qiáng)，唐歡，許海甲，廖文，潘峰，劉農(nóng)樂

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨一科，湖北 武漢 430060；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065

無論是骨壞死、大面積骨缺損還是長節(jié)段粉碎性骨折患者，都必將面臨著成骨細(xì)胞不足、骨生成因子缺乏的困境，如何增強(qiáng)這些患者的成骨能力已是困擾骨科醫(yī)生多年的臨床難題。外源性增加骨病區(qū)域的成骨細(xì)胞和骨生成因子，無疑能為治愈這些疾病奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是骨髓干細(xì)胞中具有成骨分化潛能的主要細(xì)胞群，目前已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療中，而在骨科疾患如骨折、骨壞死和骨質(zhì)疏松癥等的應(yīng)用中也體現(xiàn)了良好的臨床應(yīng)用前景。1998 年Komori等[1]證實(shí)，在MSC向成骨細(xì)胞系的分化過程中存在一種特異性的轉(zhuǎn)錄因子來決定這一分化過程，這種轉(zhuǎn)錄因子就是核心結(jié)合因子α1（core binding factor alpha 1，Cbfa1），并證實(shí)Cbfa1 基因是骨形成的關(guān)鍵基因，它對(duì)維持骨的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。Cbfa1是Cbfa家族成員，又被稱為多瘤病毒增強(qiáng)結(jié)合蛋白2αA 或急性骨髓性白血病因子3，最近又被命名為Runx2。目前已知Cbfa1 mRNA 全長約14 kb，由9個(gè)外顯子組成。Cbfa1有3個(gè)異形體，第3個(gè)異形體Cbfa1/Osf2 的N 端由MLHSPH 構(gòu)成，僅在骨組織和成骨細(xì)胞中有表達(dá)，在其他組織中未見表達(dá)[2]。Cbfa1/Osf2 是人類第一個(gè)、也是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，具有極大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。我們擬構(gòu)建含Cbfa1 基因的重組腺病毒載體，為后期應(yīng)用Cbfa1治療股骨頭壞死、骨折、骨缺損和骨質(zhì)疏松癥等疾患奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293 細(xì)胞、MSC、大腸桿菌BJ5183 來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室；Adeasy 系統(tǒng)購自Stratagene 公司；PCR 酶、限制性內(nèi)切酶、修飾酶和工具酶購自Promega公司；Real-time 檢測(cè)試劑盒購自TaKaRa 公司；Cbfa1 兔抗鼠單克隆抗體購自Santa Cruz 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；Cbfa1全長引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長度為1015～2559 bp，引物為P1（5'-CGGGAATGATGAGAACTAC-3'）和P2（5'-ACCGTCCACTGTCACTTTA-3'）。

1.2 PCR擴(kuò)增Cbfa1片段、克隆

由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成1015～2559 bp 的目的基因Cbfa1，并將其克隆到Teasy 載體上。PCR 擴(kuò)增目的基因Cbfa1（攜帶BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)），并將其克隆到pShuttle-CMV 載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，獲得載體pShuttle-CMV-Cbfa1，先通過酶切鑒定是否正確，再行測(cè)序鑒定目的基因序列。

1.3 采用Adeasy系統(tǒng)制備獲得重組腺病毒質(zhì)粒

按照Adeasy系統(tǒng)說明書進(jìn)行操作。將pShuttle-CMV-Cbfa1用PmeⅠ酶切，使其線性化，然后進(jìn)行去磷酸化處理；接著，將其進(jìn)行酚氯仿抽提純化；取1μg 線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)100μL BJ5183-Adeasy 感受態(tài)細(xì)胞；最后，在卡那霉素抗性LB 平板上篩選獲得陽性克隆，通過PacⅠ酶切鑒定結(jié)果是否正確。

1.4 AdEasy1/Cbfa1的形成、病毒滴度測(cè)定及純化

按照Adeasy 系統(tǒng)說明書進(jìn)行操作。將Ad5-pSh-CMV-Cbfa1 經(jīng)PacⅠ酶切后用酚氯仿抽提，并測(cè)定其純度和濃度（純度：D260nm/D280nm=1.8652；濃度=425 ng/μL）；分別取0.8、1.2μg，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況，可見7 d產(chǎn)生噬斑，10 d 出現(xiàn)完全病變，病變完全形成后收集上清液感染293T 細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，離心后留上清即為病毒液。再將病毒液按不同比例（1∶103～1∶1011）稀釋，取稀釋液100μL 加至293T 細(xì)胞培養(yǎng)板（96 孔）中，24 h 后于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP 陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算病毒滴度［病毒滴度（pfu/mL）=GFP 陽性細(xì)胞數(shù)×病毒上清稀釋率/0.1 mL］，2 次CsCl 梯度離心，收集病毒層，過濾后小份分裝，-70℃保存。

1.5 AdEasy1/Cbfa1感染MSC后Cbfa1 mRNA的表達(dá)

參照Halvorsen 等[3]的方法，在NCBI 數(shù)據(jù)庫找到Cbfa1 基因序列，用Premier 5 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所有引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。Cbfa1 上游引物為5'-CCCAGCCACCTTTACCTACA-3'，下游引物為5'-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3'；β-actin上游引物為5'-TCACCCACACTGTGCCCCATCTAC GA-3'，下游引物為5'-CAGCGGAACCGCTCATTGC CAATGG-3'。在37℃、5% CO2、95%空氣、100%濕度條件下培養(yǎng)72 h后檢測(cè)Cbfa1 mRNA的表達(dá)。

將MSC 按2×105/孔接種6 孔板，第2 d 用150 MOI（感染復(fù)數(shù)）的Ad-Cbfa1 感染MSC，并以不感染的MSC 作為對(duì)照，感染后48 h 收集細(xì)胞，提取RNA，-80℃保存?zhèn)溆茫蝗?.0μg RNA，用Promega公司的cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，產(chǎn)物于-20℃保存；行Real-time PCR 檢測(cè)，30μL 反應(yīng)體系包括2×PCR 反應(yīng)液15μL，上、下游引物各1μL，cDNA 模板1μL，無菌水12μL，反應(yīng)條件為50℃2 min、95℃2 min、95℃3 s、60℃30 s，共41 個(gè)循環(huán)；測(cè)出各組目的基因mRNA 的相對(duì)定量，并計(jì)算其和β-actin mRNA的比值。

1.6 AdEasy1/Cbfa1感染MSC后Western印跡檢測(cè)

將MSC消化離心后轉(zhuǎn)移到EP管中，加入裂解液（每孔200μL 細(xì)胞裂解液，每100μL 裂解液加1μL 蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，吸取上清，4℃、12 000 r/min 離心15 min，上清即為含有總蛋白的提取液，可在-70℃冰箱中保存，取5μL測(cè)定蛋白濃度，以每泳 道10μL（3μg/μL）進(jìn)行SDSPAGE，電泳完畢后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜，室溫下用脫脂奶粉封閉3 h 后加入Cbfa1 兔抗鼠單克隆抗體（1∶200），4℃過夜，TBST 洗膜3 次，室溫下用二抗（1∶200）孵育2 h，TBST 洗膜3 次，ALP 顯色，SDS-8000 成像系統(tǒng)拍照。每組5 個(gè)樣本，β-actin 為內(nèi)參，采用ScnImage圖像分析軟件測(cè)定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 目的基因載體pShuttle-CMV-Cbda1和重組質(zhì)粒Ad5-pSh-CMV-Cbfa1的酶切鑒定

測(cè)序表明PCR 擴(kuò)增獲得預(yù)想大小的Cbfa1 片段，目的基因載體pShuttle-CMV-Cbda1 經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確（圖1）。重組質(zhì)粒Ad5-pSh-CMV-Cbfa1經(jīng)PacⅠ酶切鑒定亦正確（圖2）。

2.2 AdEasy1/Cbfa1感染MSC的效率

AdEasy 系統(tǒng)攜帶有GFP，根據(jù)GFP 計(jì)數(shù)法得出腺病毒的滴度為1×1010U/mL。當(dāng)AdEasy1/Cbfa1 感染MSC 后，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；當(dāng)MOI 為80 時(shí)，80%的細(xì)胞出現(xiàn)熒光，表明所構(gòu)建的腺病毒能夠有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因（圖3）。

2.3 Real-time PCR 檢測(cè)Cbfa1 mRNA的表達(dá)

一般情況下，MSC 中Cbfa1 mRNA 的表達(dá)量很低，但AdEasy1/Cbfa1 轉(zhuǎn)染后MSC 中Cbfa1 mRNA 的表達(dá)水平提高了近千倍，說明導(dǎo)入的外源性Cbfa1能極大地增強(qiáng)MSC表達(dá)Cbfa1 mRNA的能力（圖4）。

2.4 Western印跡檢測(cè)Cbfa1蛋白的表達(dá)

圖1 pShuttle-CMV-Cbfa1的酶切鑒定電泳圖

圖2 PacⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒Ad5-pSh-CMV-Cbfa1

圖3 重組腺病毒AdEasy1/Cbfa1轉(zhuǎn)染MSC后GFP的表達(dá)

一般情況下，MSC 中Cbfa1 蛋白的表達(dá)水平很低，而感染AdEasy1/Cbfa1后，MSC中Cbfa1蛋白的表達(dá)提高明顯，說明導(dǎo)入的外源性Cbfa1既能極大地提高M(jìn)SC 表達(dá)Cbfa1 mRNA 的能力，同時(shí)也能極大地提高其Cbfa1蛋白表達(dá)能力（圖5）。

3 討論

嚴(yán)重骨壞死、大面積骨缺損及長節(jié)段粉碎性骨折患者，其損傷組織周圍的微環(huán)境因血供銳減常發(fā)生嚴(yán)重低氧，損傷中心區(qū)域的氧濃度甚至?xí)抵?～2%，在這種環(huán)境中，對(duì)缺氧敏感的骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在12～48 h 即會(huì)死亡[4-6]。同時(shí)，低氧使損傷區(qū)域里代謝產(chǎn)物大量累積，這些代謝產(chǎn)物具有毒性作用，會(huì)進(jìn)一步增加細(xì)胞凋亡和死亡的數(shù)目。另外，低氧還可對(duì)骨組織細(xì)胞活力產(chǎn)生直接影響，抑制成骨細(xì)胞生長、分化及其骨形成能力[6]。此外，這些損傷還可造成患者的MSC 活性降低和數(shù)量減少，如Suh 發(fā)現(xiàn)骨壞死病人股骨近端MSC 增殖能力、成骨能力明顯下降，而成脂能力卻增加[7]；Wang發(fā)現(xiàn)骨壞死患者的干細(xì)胞活性明顯降低，且干細(xì)胞庫的細(xì)胞集落數(shù)明顯減少[8]。綜上所述，骨缺血性壞死后患者全身骨髓MSC 活性和成骨能力降低[9]，以及病變區(qū)局部MSC和骨細(xì)胞的數(shù)量減少、活性降低[10-11]，使骨壞死后無法有效地完成骨重建或修復(fù)。

間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來源的一類多能干細(xì)胞，因其具有多向分化潛能和自我復(fù)制的特點(diǎn)而日益受到關(guān)注，目前已作為理想的干細(xì)胞用于多種疾患的治療。如近年來MSC 已被較多地用于股骨頭壞死治療，并取得了較大進(jìn)展。Yan[11]和Gangji[12]等在髓芯減壓的基礎(chǔ)上植入自體MSC，證實(shí)MSC 能提供股骨頭修復(fù)重建所需的種子細(xì)胞，為新骨生成創(chuàng)造良好的環(huán)境。Müller 等[13]對(duì)白血病患兒的股骨頭壞死進(jìn)行髓芯減壓、自體MSC 移植，隨訪16個(gè)月，所有患兒的骨壞死區(qū)均可見礦化骨形成。既往我們也應(yīng)用MSC 治療實(shí)驗(yàn)性兔股骨頭壞死，通過X 線、CT、組織學(xué)、Real-time PCR、Western 印跡等多種檢測(cè)，證實(shí)外源性MSC 植入動(dòng)物體內(nèi)能增加新骨形成所需的成骨細(xì)胞，為骨壞死修復(fù)奠定基礎(chǔ)[14]。

圖4 Real-time PCR 檢測(cè)AdEasy1/Cbfa1轉(zhuǎn)染MSC后Cbfa1 mRNA的表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)AdEasy1/Cbfa1轉(zhuǎn)染MSC后Cbfa1的表達(dá)

然而，骨生成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，除了相關(guān)細(xì)胞外，還需要眾多細(xì)胞因子或生長因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板衍化生長因子（PDGF）、Cbfa1等參與，甚至有些學(xué)者認(rèn)為在MSC 修復(fù)損傷的組織和器官中，更多的是依靠其自分泌和旁分泌的各種生長因子，而不是其自身的定向分化。我們?cè)谕霉侨睋p和股骨頭壞死模型中都發(fā)現(xiàn)病變局部BMP-2、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、Cbfa1、骨橋蛋白（OPN）等生長因子的表達(dá)發(fā)生變化，而且在不同病變期其表達(dá)存在較大差異。尤其是Cbfa1 在骨折和股骨頭壞死修復(fù)過程中會(huì)自發(fā)持續(xù)高水平表達(dá)，表明其在這些疾患的修復(fù)中起重要作用[15-16]。Cbfa1/Osf2 參與成骨細(xì)胞分化，通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因和成骨表型相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)MSC 向成骨分化和生成新骨。已發(fā)現(xiàn)在骨鈣素、骨唾液蛋白、Ⅰ型膠原纖維等多種成骨特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子存在與Cbfa1 特異結(jié)合的成骨細(xì)胞特異性順式反應(yīng)元件。骨生成誘導(dǎo)因子與Cbfa1 存在相互增強(qiáng)的作用，骨誘導(dǎo)因子可通過Cbfa1 促進(jìn)成骨，Cbfa1 也可上調(diào)骨誘導(dǎo)因子或其受體的表達(dá)。說明在骨生成的復(fù)雜過程中，Cbfa1是多種骨生成誘導(dǎo)因子促進(jìn)成骨的共同信號(hào)分子。

雖然Cbfa1 在骨缺損和股骨頭壞死修復(fù)過程中會(huì)持續(xù)出現(xiàn)高水平表達(dá)，但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，要修復(fù)這些疾患不僅需要持續(xù)高水平的Cbfa1表達(dá)，還需要達(dá)到一定的數(shù)值才能有效促進(jìn)骨缺損和骨壞死修復(fù)[15]。尤其是在一般情況下MSC 分泌產(chǎn)生的Cbfa1量非常少，這樣要在骨缺損和骨壞死局部維持高濃度的Cbfa1，單純依靠外源性MSC 產(chǎn)生顯然不夠。為了增強(qiáng)MSC 分泌Cbfa1 的能力，人為地將外源性Cbfa1 基因通過載體導(dǎo)入MSC 無疑是一種可行的良好選擇。為了證實(shí)外源性Cbfa1 基因?qū)氪_實(shí)能提高M(jìn)SC 分泌Cbfa1 的能力，我們?cè)诖_認(rèn)AdEasy1/Cbfa1 構(gòu)建成功后直接將它感染MSC，通過檢測(cè)其mRNA和蛋白水平，證實(shí)MSC分泌Cbfa1的能力提高了近千倍，為下一步應(yīng)用AdEasy1/Cbfa1治療骨缺損和股骨頭壞死修復(fù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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