張曉清 ，王健，王洪濤，李山虎，王芃，黃芳，洪鎏，鄧楚中，周建光

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，在歐美國家其發(fā)病率居首位，死亡率高居第二位[1]。PC-1/PrLZ基因是癌基因D52家族成員，其在雄激素非依賴性前列腺癌C4-2 細(xì)胞中高表達(dá)而在雄激素依賴性LNCaP 細(xì)胞中低表達(dá)，且隨著前列腺癌分級的增加表達(dá)上升[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，PC-1 可以激活PI3K/AKT 信號通路，進(jìn)而抑制雄激素，剝奪對前列腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用[4-5]。PI3K/AKT 信號通路可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成和腫瘤發(fā)育等促進(jìn)前列腺癌雄激素非依賴進(jìn)展，而PC-1如何激活該信號通路還不清楚。

我們利用慢病毒系統(tǒng)建立了過表達(dá)和干擾PC-1表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞模型，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)PC-1可以抑制mTOR 激酶信號通路下游分子S6K 的活性，進(jìn)而解除了S6K對AKT的負(fù)反饋抑制功能，從而激活A(yù)KT激酶的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、LNCaP 及C4-2 細(xì)胞，大腸桿菌DH5α，PC-1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-HA-PC-1，慢病毒包裝輔助質(zhì)粒由本室保存；DMEM 及RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO 公司；優(yōu)等胎牛血清（FBS）為Hyclone公司產(chǎn)品；慢病毒過表達(dá)載體pCDH-EF1-Myc-MCS-T2A-Puro和干擾表達(dá)載體pSIH1-H1-Puro 由金蕊博士饋贈；限制性內(nèi)切酶、Pfu酶和DNA 連接酶購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取、膠回收和PCR 回收試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑VigoFect 均為維格拉斯公司產(chǎn)品；聚凝胺（Polybrene）、嘌呤霉素購自Santa Cruz 公司；PC-1 多克隆抗體由本室自制；γ-tubulin 及抗S6Kp389、S6K、AKT、p308-AKT 抗體購自Cell Signaling公司；蛋白酶抑制劑購自Sigma 公司；雷帕霉素、RAD001和AG1024購自Selleck公司。

1.2 短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PC-1的shRNA 靶點(diǎn)為GCTATCTCTACTTGTC TCC，以此設(shè)計(jì)shRNA 正義鏈序列（5'-GATCCGCT ATCTCTACTTGTCTCCCTTCCTGTCAGAGGAGACA AGTAGAGATAGCTTTTTG-3'）和反義鏈序列（5'-AATTCAAAAAGCTATCTCTACTTGTCTCCTCTGAC AGGAAGGGAGACAAGTAGAGATAGCG-3'）。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切shRNA 表達(dá)載體pSIH1-H1-Puro，回收后與退火的PC-1shRNA 片段連接，構(gòu)建PC-1shRNA 慢病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)公司測序鑒定。

1.3 PC-1過表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PC-1基因正向引物為5'-ACGGATCCGATTGT AGAGAGATGGAC-3'，反向引物為5'-GAGCGGCC GCCAGGCTCTCCTGTGTCTT-3'。以pcDNA-HAPC-1 為模板，PCR 擴(kuò)增并切膠回收PC-1基因DNA片段；分別將載體pCDH-EF1-Myc-MCS-Puro和PC-1回收片段用BamHⅠ/NotⅠ于37℃雙酶切12 h，酶切產(chǎn)物切膠回收后于16℃連接12 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆提取質(zhì)粒，用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定。

1.4 慢病毒的包裝

適量293T 細(xì)胞接種于100 mm 培養(yǎng)皿，約24 h后轉(zhuǎn)染，包裝4種質(zhì)粒慢病毒，即PC-1shRNA、其對照載體pSIH1-H1-Puro、過表達(dá)PC-1載體和對照載體pCDH-EF1-Myc-MCS-Puro。將4 種質(zhì)粒分別與3 個(gè)包裝質(zhì)粒（REV，VSVG，RRE）在空白DMEM 中混合，加入VigoFect 轉(zhuǎn)染試劑混勻后室溫靜置20 min，分別加入4 皿細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃孵箱培養(yǎng)12 h 后，換成含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液，48 h 后收集上清，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾即得包裝好的病毒，直接加到待感染細(xì)胞中或于-80℃保存。

1.5 前列腺癌細(xì)胞系的建立

接種LNCaP、C4-2細(xì)胞于100 mm 培養(yǎng)皿中，用含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h 后加入包裝好的含有過表達(dá)PC-1及其對照載體、敲低PC-1表達(dá)及其對照載體的4種病毒液，同時(shí)加入終濃度為5μg/mL 的Polybrene，病毒感染10 h 后換成普通培養(yǎng)液，48 h后傳代，傳代時(shí)培養(yǎng)液里加入2μg/mL嘌呤霉素篩選，進(jìn)一步培養(yǎng)鑒定。

1.6 Western印跡分析

收集細(xì)胞，提取總蛋白，將蛋白提取液與5×SDS上樣緩沖液以4∶1 的體積比混勻，煮沸10 min 后離心，取樣進(jìn)行SDS-PAGE 后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；將膜用5%脫脂奶粉于室溫封閉30 min；加入所需一抗于室溫孵育1 h 或4℃過夜后，TBST 洗膜3次，每次7 min；用相應(yīng)的二抗孵育后，洗膜3 次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 建立過表達(dá)PC-1 的LNCaP 穩(wěn)定細(xì)胞系及敲低PC-1表達(dá)的C4-2穩(wěn)定細(xì)胞系

包裝慢病毒后分別感染前列腺癌LNCaP和C4-2 細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后收集細(xì)胞，提取總蛋白，Western 印跡檢測細(xì)胞內(nèi)PC-1 的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。相對于各自對照細(xì)胞，LNCaP 細(xì)胞中的PC-1蛋白表達(dá)水平明顯上升，而感染PC-1shRNA 慢病毒C4-2 細(xì)胞中的PC-1 蛋白表達(dá)水平明顯下降，表明穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.2 PC-1抑制前列腺癌細(xì)胞中S6K激酶的活性

為檢測PC-1 是否影響AKT 信號通路下游mTOR信號通路活性，我們檢測了細(xì)胞內(nèi)S6K-p389、70S6K 表達(dá)水平。結(jié)果表明LNCaP 細(xì)胞中PC-1 過表達(dá)對總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響，但抑制其磷酸化水平（圖2A）；在C4-2細(xì)胞中，敲低PC-1表達(dá)使S6K磷酸化水平上升（圖2B），對總蛋白水平?jīng)]有影響。提示PC-1能夠調(diào)控S6K激酶的活性。

為進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果,我們用不同濃度的mTOR 抑制劑雷帕霉素平行處理這4 種細(xì)胞，24 h后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western 印跡檢測。結(jié)果顯示（圖2C），雷帕霉素呈劑量效應(yīng)型抑制S6K-p389水平；而PC-1 高表達(dá)能夠增強(qiáng)雷帕霉素對S6Kp389 的抑制作用，敲低PC-1 表達(dá)能夠抑制雷帕霉素對S6K-p389的抑制作用。進(jìn)一步表明PC-1能夠抑制前列腺癌細(xì)胞中S6K激酶的活性。

2.3 PC-1 解除S6K 激酶對AKT 激酶活性的負(fù)反饋抑制

圖1 PC-1過表達(dá)及敲低表達(dá)前列腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定

圖2 PC-1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞中S6K激酶的活性

圖3 PC-1解除S6K負(fù)反饋調(diào)控AKT信號通路

LNCaP、LNCaP-PC-1 細(xì)胞中S6K和AKT 磷酸化水平檢測結(jié)果見圖3。PC-1過表達(dá)時(shí)S6K 磷酸化水平下降，而AKT的磷酸化水平上升；當(dāng)用mTOR抑制劑RAD001 處理細(xì)胞完全抑制S6K 的活性后，PC-1過表達(dá)和對照細(xì)胞中AKT 的磷酸化水平相當(dāng)。提示PC-1可能通過抑制S6K 活性，解除S6K 對AKT 激酶活性的負(fù)反饋抑制作用，進(jìn)而上調(diào)AKT活性。

3 討論

AKT信號通路在腫瘤細(xì)胞中異常激活導(dǎo)致細(xì)胞的表型惡性轉(zhuǎn)化，mTOR 蛋白激酶是PI3K/AKT 信號通路下游的重要組分。mTOR 信號通路主要包含2個(gè)蛋白復(fù)合體mTORC1和mTORC2。mTORC1 通過調(diào)控它的2 個(gè)底物分子S6K和4E-BP1 來調(diào)控細(xì)胞的大小和蛋白質(zhì)翻譯；mTORC2 參與了對AKT 第473氨基酸殘基的磷酸化調(diào)控[6-7]。

mTOR 依賴的S6K 磷酸化激活參與了蛋白質(zhì)的翻譯起始和延伸，但該分子的激活又啟動了一條負(fù)反饋通路抑制AKT 信號通路活性[8]。我們首先發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PC-1 在前列腺癌細(xì)胞中能夠激活A(yù)KT 信號通路，同時(shí)能抑制S6K 的磷酸化水平，提示PC-1 可能解除了S6K對AKT活性的負(fù)反饋抑制作用。雷帕霉素及其衍生物RAD001 是mTOR 信號通路的有效抑制劑，能抑制其下游底物分子如S6K 的活性。用RAD001 處理PC-1 過表達(dá)及對照LNCaP 細(xì)胞，當(dāng)S6K 活性被完全抑制后，PC-1 對AKT 激酶的激活作用消失，提示PC-1對S6K 激酶活性的調(diào)控參與了其對AKT活性的調(diào)控。

本研究表明PC-1 通過抑制mTOR 信號通路下游分子S6K 激酶的活性，解除了S6K 對AKT 信號通路的負(fù)反饋抑制，從而激活A(yù)KT 信號通路。這一結(jié)果揭示了PC-1激活A(yù)KT活性的可能分子機(jī)制。

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