蔡紅艷 ，陳保立，梁未麗，王多春，李杰，段國賢，闞飆

1.河北聯(lián)合大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東省傳染病預(yù)防控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.中國疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

細(xì)菌中的環(huán)腺苷酸受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）是一種全局性調(diào)控因子，最早在大腸桿菌分解代謝產(chǎn)物阻遏過程中被鑒定出[1]。CRP 與cAMP 形成cAMP-CRP 聚合體后與啟動子上游保守序列TGTGA-（N6）-TCACA 結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[1-2]。在大腸桿菌中CRP 的調(diào)控作用已經(jīng)得到較深入的研究，已發(fā)現(xiàn)至少有378 個基因受到CRP的調(diào)控[3]，轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)表明CRP 對碳源核心代謝通路上的酶及轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)錄有調(diào)控作用[4]?；魜y弧菌CRP 的基因和蛋白序列與大腸桿菌的CRP分別有81%和95%的一致性[5-6]，這提示CRP 在霍亂弧菌與大腸桿菌中有著相似的作用。CRP在霍亂弧菌中功能的研究主要集中在其對毒力基因的調(diào)控上，如CRP 調(diào)控霍亂毒素和菌素共調(diào)節(jié)菌毛基因的轉(zhuǎn)錄[7]、調(diào)控血凝素/蛋白酶的產(chǎn)生[8]。另外，CRP 還影響密度感應(yīng)系統(tǒng)及霍亂弧菌在腸道中生存所必需基因的轉(zhuǎn)錄[9]。

我們曾利用表型芯片檢測、轉(zhuǎn)錄水平分析、調(diào)控蛋白結(jié)合DNA 調(diào)控區(qū)的實(shí)驗(yàn)方式，分析了霍亂弧菌中CRP 對不同碳源利用的調(diào)節(jié)作用，找到24 種被CRP 調(diào)控利用的碳源，其中11 種未在細(xì)菌中見到受CRP 調(diào)控的報(bào)道[10]。其中，發(fā)現(xiàn)參與L-天冬氨酸代謝的VC0391（編碼天冬氨酸激酶，aspartokinase isozymes，AK）和VC2364（編碼高絲氨酸脫氫酶，homoserine dehydrogenase，HDH）基因受CRP 的調(diào)控。天冬氨酸是一種α-氨基酸，其異構(gòu)物L(fēng)-天冬氨酸是20種蛋白氨基酸之一。天冬氨酸代謝通路廣泛存在于植物及微生物中，涉及的步驟及參與的酶均比較保守。在大腸桿菌中，天冬氨酸在AK的作用下生成磷酸化天門氨酰。共有3 類AK，其中AKⅠ和AKⅡ是雙功能酶，酶的活性分別受到蘇氨酸和甲硫氨酸的反饋抑制；AKⅢ為單功能酶，受到賴氨酸的反饋抑制。磷酸化天門氨酰在天冬氨酸-β-半醛脫氫酶（aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase，ASADH）的作用下生成天冬氨酸-β-半醛，而后在HDH 的作用下生成高絲氨酸，進(jìn)而生成甲硫氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸，或者在二氫吡啶二羧酸合成酶（dihydrodipicolinate synthase）的作用下生成四氫吡啶二羧酸，進(jìn)而生成賴氨酸。

我們的前期研究證實(shí)，參與L-天冬氨酸代謝的VC0391基因啟動子區(qū)與CRP 直接結(jié)合，雖看到CRP對編碼HDH 的VC2364 基因的調(diào)控效果，但未發(fā)現(xiàn)VC2364 基因調(diào)控區(qū)典型的CRP 結(jié)合位點(diǎn)及CRP 的直接結(jié)合作用[10]。在本研究中，我們進(jìn)一步分析了CRP對VC2364基因的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)將霍亂弧菌中VC2364 基因啟動子區(qū)非典型的CRP 結(jié)合序列該造為典型序列后，增強(qiáng)了受CRP 調(diào)控的作用，顯示原VC2364基因序列能促使CRP的弱調(diào)控，提示霍亂弧菌中可能存在的受CRP精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株與質(zhì)粒見表1。大腸桿菌與霍亂弧菌在LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入合適的抗生素。大腸桿菌培養(yǎng)所加氯霉素（Cm）終濃度為10 mg/mL；霍亂弧菌所加Cm 終濃度為2 mg/mL，多黏菌素B終濃度為0.1 U/mL。

PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；DNA 提取試劑盒、PCR 擴(kuò)增用2×Pfumaster Mix 購自天根公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自TaKaRa 公司；酶聯(lián)檢測儀Infinite M200 Pro 購自Tecan 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning 公司；PCR 儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀購自Bio-Rad 公司；生物安全柜Forma ClassⅡ，A2，購自Thermo公司。

1.2 CRP結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測與搭橋PCR

分別用Virtual Footprint[11]和Regulatory Sequence Analysis Tools（RSAT）[12]軟件預(yù)測可能的CRP 結(jié)合位點(diǎn)。為了將VC2364 基因的啟動子序列中與CRP 結(jié)合位點(diǎn)保守序列不一致的3 個堿基替換成保守序列，我們在預(yù)測堿基位點(diǎn)上下游500 bp 同源臂處設(shè)計(jì)引物P1、P2、P3、P4，通過P2、P3 的設(shè)計(jì)將不一致的序列置換為CRP 保守序列。在引物P2、P3 的5'端各取10 個堿基反向互補(bǔ)，將P2 反向互補(bǔ)序列加在P3 的5'端,P3 反向互補(bǔ)序列加在P2 的5'端，并在P1、P4 引物的5'端加上酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基。以C7258 基因組DNA 為模板，分別以引物P1、P2和P3、P4 擴(kuò)增得到同源臂，將擴(kuò)增得到的2 個PCR 產(chǎn)物片段按1∶1 的比例混合后純化回收，以純化回收的PCR 產(chǎn)物為模板，用引物P1、P4 進(jìn)行搭橋PCR 擴(kuò)增，得到上下游同源臂搭橋序列片段。引物序列見表2。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建

未改造的PCR 產(chǎn)物、搭橋PCR 產(chǎn)物、pBBRlux 質(zhì)粒分別用PvuⅠ和SacⅠ雙酶切后切膠回收，酶切產(chǎn)物用T4DNA 連接酶連接1 h，取5μL 轉(zhuǎn)入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，加入1 mL液體LB，37℃搖床振搖40 min后離心，取100μL液體涂布于含Cm的平板培養(yǎng)基上，待長出菌落后，挑取50 個菌落用pBBRlux-PvUⅠ、pBBRLux-BamHⅠ引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，挑取陽性菌落，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pvc2364-lux、pvc2364s-lux。

表1 研究使用的菌株與質(zhì)粒

表2 質(zhì)粒構(gòu)建所用引物及序列

1.4 接合轉(zhuǎn)移

將質(zhì)粒pvc2364-lux、pvc2364s-lux 分別轉(zhuǎn) 入SM10 供體菌、受體菌（C7258、WL7258），各取0.6 mL 菌液混合，5000 r/min 離心5 min，棄上清，用1 mL LB 懸菌后再次離心，棄上清，用80μL LB 懸菌，將菌液點(diǎn)到高壓滅菌并平貼于LB 平板上的0.45μm 的微孔水系濾膜上，菌液吸收后于37℃溫箱中培養(yǎng)4～6 h，用LB 沖洗濾膜，收集洗液，離心后沉淀重懸于適量LB，涂布于質(zhì)粒所帶抗性多黏菌素B和霍亂弧菌所帶抗性Cm 的培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過夜。

1.5 熒光值的測定

將含有pvc2364-lux，pvc2364s-lux 質(zhì)粒的霍亂弧菌活化過夜，接種于含Cm和多黏菌素B 的5 mL液體培養(yǎng)基中，第2 d 按1/1000 的比例轉(zhuǎn)接到2 mL無菌LB 中，37℃振蕩培養(yǎng)，到一定時間分別取200μL 菌液轉(zhuǎn)移到96 孔板中，于Tecan Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀中檢測熒光值，同時在該儀器中測定菌濁度（D600nm值），以時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)、熒光值/D600nm為縱坐標(biāo)，得到光值曲線。

2 結(jié)果

2.1 CRP結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

分別用Virtual Footprint和RSAT 軟件預(yù)測基因VC2364 上游是否有CRP 可能的結(jié)合位點(diǎn)。Virtual Footprint預(yù)測結(jié)果顯示VC2364基因上游431～452處有可能的CRP 結(jié)合位點(diǎn)，與保守序列有7 個位點(diǎn)一致；RSAT 未預(yù)測到VC2364 上游有CRP 可能的結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

用搭橋PCR 的方法，將VC2364 基因啟動子上游序列中與CRP 結(jié)合位點(diǎn)保守序列不一致的3 個堿基替換成保守序列，未改造的序列經(jīng)PCR 擴(kuò)增后與pBBRlux 連接并導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取PCR 擴(kuò)增陽性的菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取酶切條帶大小合適的質(zhì)粒測序，結(jié)果顯示構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒正確。圖1為改造前與改造后的序列對比。

2.3 報(bào)告質(zhì)粒在不同菌株中熒光值的測定

圖1 基因VC2364啟動子CRP結(jié)合位點(diǎn)堿基的改造

質(zhì)粒pBBRlux 利用luxCDABE 基因作為報(bào)告基因，其熒光表達(dá)需要借助插入的啟動子。將VC2364基因啟動子上游可能的CRP結(jié)合位點(diǎn)原始序列和改造序列構(gòu)建到報(bào)告質(zhì)粒pBBRlux 中，檢測報(bào)告質(zhì)粒pBBRlux 在C7258 與WL7258 菌株中的熒光值，發(fā)現(xiàn)改造的質(zhì)粒在C7258 株中的熒光值高于未改造的，在WL7258 株中的差異更明顯。另外，序列改造與未改造的質(zhì)粒在CRP野生株C7258中的熒光值均高于CRP突變株WL7258中。見圖2。

3 討論

本研究論證了細(xì)菌中CRP調(diào)控單元中一個CRP結(jié)合位點(diǎn)序列的特殊例子。我們在分析CRP對霍亂弧菌碳源代謝的影響中，發(fā)現(xiàn)了多種碳源的代謝受到CRP 調(diào)控，參與L-天冬氨酸代謝的VC2364 基因在轉(zhuǎn)錄水平上受CRP 的調(diào)控，但其啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)典型的CRP結(jié)合位點(diǎn)序列。CRP與啟動子區(qū)保守序列TGTGA-（N6）-TCACA 結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)在VC2364基因啟動子區(qū)上游有可能的CRP 結(jié)合位點(diǎn)AGCGC-（N6）-TCACA，因此這是一個不典型的CRP 結(jié)合序列，與典型序列相比有7個堿基序列一致。但從前期研究結(jié)果來看，這7個堿基序列很可能已促進(jìn)了CRP的結(jié)合和調(diào)控。為了闡明CRP 是否直接調(diào)控VC2364 的轉(zhuǎn)錄，我們利用報(bào)告質(zhì)粒比較了其啟動子在CRP野生株和缺失株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在野生株中VC2364啟動子序列啟動的表達(dá)是受CRP 調(diào)節(jié)的，因?yàn)槠湓贑RP 野生株中的表達(dá)高于在CRP缺失株中。這是對我們前期研究結(jié)果的確認(rèn)。我們也看到，在缺失株中也有啟動子序列啟動的表達(dá)，這說明該啟動子同時受到其他因素的調(diào)控。

圖2 報(bào)告質(zhì)粒在CRP野生株C7258及其突變株WL7258中熒光值的差異

CRP 識別調(diào)控區(qū)的典型結(jié)合位點(diǎn)序列是TGTGA-（N6）-TCACA，在VC2364 基因前面僅有7 個堿基與經(jīng)典結(jié)合位點(diǎn)一致，為此我們改構(gòu)了VC2364啟動子區(qū)的該區(qū)域序列，使其形成典型的CRP 結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)測定證實(shí)，改造為典型CRP結(jié)合序列后，啟動子受CRP 的作用大為增強(qiáng)，改造序列在CRP 缺失株中的熒光變化不大，但在野生株中明顯增強(qiáng)，而且改造的啟動子在CRP 野生株中，其促進(jìn)表達(dá)的熒光也超過了VC2364的野生型啟動子的作用。因此，這些結(jié)果提示，VC2364啟動子區(qū)非典型的CRP結(jié)合序列AGCGC-（N6）-TCACA 也是能被CRP 作用的，但改造為典型序列后受到CRP 更強(qiáng)的作用，激發(fā)了更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄作用。在細(xì)菌中，CRP被別構(gòu)效應(yīng)物cAMP激活并與之結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)合于靶啟動子上游特異的DNA 位點(diǎn)TGTGA-（N6）-TCACA 后與RNA聚合酶直接作用，增強(qiáng)后者在啟動子上的結(jié)合能力，從而起始轉(zhuǎn)錄。我們推測，VC2364啟動子區(qū)的這個非典型CRP結(jié)合序列，依然能夠使CRP二聚體形成較微弱的結(jié)合并發(fā)揮一定的激活作用。

在大部分植物和微生物中，天冬氨酸代謝是合成賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸所必需的，另外該途徑還產(chǎn)生許多重要的中間產(chǎn)物，如在細(xì)胞壁合成過程中起交聯(lián)作用的二氨基庚二酸及革蘭陽性菌芽胞的重要組成成分吡啶二羧酸[13]。在霍亂弧菌中，天冬氨酸代謝涉及的高絲氨酸脫氫酶基因VC2364啟動子CRP結(jié)合位點(diǎn)可能發(fā)生了突變，形成了非典型結(jié)合序列，弱化了被CRP 調(diào)控的作用。為什么沒有出現(xiàn)典型的CRP結(jié)合序列？這種序列變化弱化了CRP的調(diào)控作用，但這種突變卻被保留，其中的機(jī)制目前還不清楚，是否是適應(yīng)某類微環(huán)境而形成的適應(yīng)性改變，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。

[1]Kolb A,Busby S,Buc H,et al.Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein[J].Annu Rev Biochem,1993,62:749-795.

[2]Busby S,Ebright R H,Transcription activation by catabolite activator protein(CAP)[J].J Mol Biol,1999,293(2):199-213.

[3]Shimada T,Fujita N,Yamamoto K,et al.Novel roles of cAMP receptor protein(CRP) in regulation of transport and metabolism of carbon sources[J].Plos One,2011,6(6):e20081.

[4]Gosset G,Zhang Z,Nayyar S,et al.Transcriptome analysis of Crp-dependent catabolite control of gene expression in Escherichia coli[J].J Bacteriol,2004,186(11):3516-3524.

[5]Zhan L,Han Y,Yang L,et al.The cyclic AMP receptor protein,CRP,is required for both virulence and expression of the minimal CRP regulon in Yersinia pestis biovar microtus[J].Infect Immun,2008,76(11):5028-5037.

[6]Espert S M,Elsinghorst E A,Munson G P.The tib adherence locus of enterotoxigenic Escherichia coli is regulated by cyclic AMP receptor protein[J].J Bacteriol,2011,193(6):1369-1376.

[7]Skorupski K,Taylor R K.Cyclic AMP and its receptor protein negatively regulate the coordinate expression of cholera toxin and toxin-coregulated pilus in Vibrio cholerae[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(1):265-270.

[8]Silva A J,Benitez J A.Transcriptional regulation of Vibrio cholerae hemagglutinin/protease by the cyclic AMP receptor protein and RpoS[J].J Bacteriol,2004,186(19):6374-6382.

[9]Liang W,Pascual-Montano A,Silva A J,et al.The cyclic AMP receptor protein modulates quorum sensing,motility and multiple genes that affect intestinal colonization in Vibrio cholerae[J].Microbiology,2007,153(Pt 9):2964-2975.

[10]Chen B,Liang W,Wu R,et al.Phenotype microarray screening of carbon sources used by Vibrio cholerae identifies genes regulated by the cAMP receptor protein[J].Can J Microbiol,2013,59(7):472-478.

[11]Munch R,Hiller K,Grote A,et al.Virtual footprint and PRODORIC:an integrative framework for regulon prediction in prokaryotes[J].Bioinformatics,2005,21(22):4187-4189.

[12]Turatsinze J V,Thomas-Chollier M,Defrance M,et al.Using RSAT to scan genome sequences for transcription factor binding sites and cis-regulatory modules[J].Nat Protoc,2008,3(10):1578-1588.

[13]Viola R E.The central enzymes of the aspartate family of amino acid biosynthesis[J].Acc Chem Res,2001,34(5):339-349.