王亞楠，金蕊，馬世良，黃君健

1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

端粒保護(hù)蛋白（protection of telomeres，POT1）位于端粒末端，保護(hù)端粒的穩(wěn)定性[1-2]。在人類細(xì)胞中，POT1、TPP1、RAP、TRF1、TRF2和TIN2 形成一個(gè)蛋白六聚體，定位于端粒末端，其中POT1 與端粒末端的單鏈序列TTAGGG 具有很強(qiáng)的結(jié)合力，且這種結(jié)合具有序列特異性[3-4]。POT1 與其他端粒蛋白一起保護(hù)端粒末端，使其區(qū)別于DNA 斷端，防止被核酸酶分解，抑制ATR 依賴的DNA 損傷反應(yīng)的發(fā)生，POT1 決定人類染色體末端的結(jié)構(gòu)，保護(hù)染色體末端避免非同源重組[5]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，POT1 對(duì)端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)具有雙重作用，既可能延長(zhǎng)端粒也可能縮短端粒，表明POT1在細(xì)胞中的表達(dá)水平對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝是非常重要的[6]。

在EBI 網(wǎng)站（http://www.ebi.ac.uk/）搜索，已通過(guò)酵母雙雜交方法驗(yàn)證與POT1 有相互作用的蛋白很多，如KRT18、AVTN4、ZNF32、GRB、MDM2、MVP等，其中MDM2 是一個(gè)E3 泛素化連接酶，細(xì)胞水平上MDM2 與POT1 是否有相互作用及MDM2 對(duì)POT1是否具有調(diào)節(jié)功能仍是未知的。

鼠雙微體2 同源體（mouse double minute 2 homolog，MDM2，也被稱作E3 泛素化蛋白連接酶MDM2）是一個(gè)癌基因的編碼產(chǎn)物[7-8]，由491 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為56×103。它包含一些保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括N 端P53 結(jié)合位點(diǎn)、中心的酸性區(qū)域（230～300 殘基）、鋅指區(qū)域和C 端的RING 區(qū)域（430～480 殘基）[9-10]。MDM2 對(duì)P53 腫瘤抑制因子起負(fù)調(diào)控的作用，一方面它抑制P53 的轉(zhuǎn)錄激活[11]，同時(shí)也作為E3泛素化連接酶，主要通過(guò)蛋白酶體途徑降解其自身和P53，它識(shí)別P53的N 端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域（TAD）使其降解[12]。研究發(fā)現(xiàn)，MDM2基因在人類的許多惡性腫瘤中高表達(dá)[13-14]。

探究MDM2與POT1的相互關(guān)系，對(duì)腫瘤的治療研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)Flag-POT1的HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；蛋白酶體抑制劑MG132、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Sigma 公司；LipofectAMINE 2000、LipofectAMINE RNAiMAX、MDM2 siRNA 均購(gòu)自Invitrogen 公司；MDM2 抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司；Flag 抗體、Myc 抗體購(gòu)自MBL 公司；GAPDH 抗體購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司；Western 印跡顯色試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa 細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)外源Flag-POT1 的HeLa 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

從Invitrogen 公司購(gòu)買3 條MDM2 siRNA（MDM2si1、MDM2si2、MDM2si3）及1 條對(duì)照siRNA（MDM2sicontrol），按照說(shuō)明書(shū)稀釋至5μmol/L；將HeLa 細(xì)胞用胰酶消化，用無(wú)血清的DMEM 吹打混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取約105細(xì)胞加入6 孔板的一個(gè)孔；分別取siRNA 各3μL 加入500μL 無(wú)抗生素?zé)o血清的DMEM 中，再分別加入3μL RNAiMAX，混勻，靜置20 min，分別加入6 孔板中，混勻，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)其抑制效果。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將HeLa 細(xì)胞鋪6 孔板，當(dāng)細(xì)胞鋪板面的70%～80%時(shí)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒Myc-MDM2 及Flag-POT1，轉(zhuǎn)染程序按照LipofectAMINE 2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.5 Western印跡檢測(cè)siRNA的抑制效果

收集細(xì)胞后，用RAPI 裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h，一抗孵育2 h，用TBST清洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，用TBST 清洗3 次，每次5 min，按照Western 印跡顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)顯色1～2 min，暗室壓片顯影。

1.6 免疫共沉淀驗(yàn)證MDM2與POT1的相互作用

收集細(xì)胞后，加入中鹽IP 緩沖液，冰上裂解30 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的Ep 管中，取出20%凍存，其余上清備用；取瓊脂糖珠Flag-beads（每個(gè)樣品20μL），用中鹽IP 緩沖液平衡，加入IP緩沖液500μL，3000 r/min、4℃離心1 min，棄上清，重復(fù)上述操作3 次；將Flag-beads 用IP緩沖液重懸，均分到待用上清液中，用裂解液補(bǔ)足500μL，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；用裂解液洗3 次，每次10 min，旋轉(zhuǎn)清洗，3000 r/min、4℃離心2 min，留少量上清，加入5×上樣緩沖液煮10 min，電泳上樣，后續(xù)步驟同Western印跡。

2 結(jié)果

2.1 用MG132 處理穩(wěn)定表達(dá)Flag-POT1 的HeLa 細(xì)胞

2 皿Flag-POT1 細(xì)胞，其中一皿不做處理，另一皿加10μmol/L MG132 處理6 h 后收集細(xì)胞，Western 印跡檢測(cè)，結(jié)果（圖1）表明Flag-POT1 的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯升高并且有拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明POT1是通過(guò)蛋白酶體-泛素化途徑降解的。

2.2 MDM2 siRNA對(duì)MDM2蛋白的抑制效果

在HeLa 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染MDM2sicontrol、MDM2si1、MDM2si2和MDM2si3，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western印跡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)PS5軟件分析，發(fā)現(xiàn)3條siRNA 對(duì)MDM2 都有不同程度的抑制作用，抑制率分別為35%、40%和88%，MDM2si3 的抑制效果最好（圖2）。表明MDM2si3 對(duì)MDM2 具有較好的沉默效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將用MDM2si3來(lái)抑制MDM2的表達(dá)。

圖1 MG132處理HeLa細(xì)胞后Flag-POT1的表達(dá)情況

2.3 Flag-POT1與Myc-MDM2的相互作用

3 皿HeLa 細(xì)胞，一皿轉(zhuǎn)入Myc-MDM2 質(zhì)粒，一皿轉(zhuǎn)入Flag-POT1 質(zhì)粒，一皿用Myc-MDM2 質(zhì)粒和Flag-beads 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明POT1與MDM2有較強(qiáng)的相互作用（圖3）。

2.4 MDM2對(duì)Flag-POT1表達(dá)水平的影響

3 皿Flag-POT1 細(xì)胞，一皿不做處理，一皿轉(zhuǎn)入Myc-MDM2 質(zhì)粒，一皿轉(zhuǎn)入MDM2si3，48 h 后收集細(xì)胞行Western 印跡，結(jié)果表明MDM2 對(duì)POT1 的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響（圖4）。說(shuō)明MDM2 雖然與POT1 在細(xì)胞水平存在相互作用，但MDM2 不是POT1 的E3 泛素化連接酶，或者說(shuō)不是主要的E3 泛素化連接酶。

3 討論

圖2 MDM2 siRNA對(duì)MDM2蛋白的抑制效果

圖3 Flag-POT1與Myc-MDM2的相互作用

圖4 MDM2對(duì)Flag-POT1表達(dá)水平的影響

POT1 是端粒復(fù)合體shelterin 的主要成員，主要與端粒3'端結(jié)合，保護(hù)端粒的完整性，在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生異常或基因序列發(fā)生突變。與意義未定的單克隆丙種球蛋白病（MGUS）病人相比，多發(fā)性骨髓瘤（MM）病人中POT1 的基因表達(dá)明顯升高，它可能參與MGUS 到MM 的轉(zhuǎn)變過(guò)程[15]。胃癌晚期較胃癌早期POT1的表達(dá)水平顯著升高，其成為惡性程度的標(biāo)志[16]。在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）中，Tyr36、Lys90、Gln94 發(fā)生突變，使POT1 不能與端粒3'單鏈結(jié)合，導(dǎo)致端粒功能異常[17]。這些表明POT1在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用，成為疾病前期診斷的依據(jù)，為設(shè)計(jì)新的治療策略的可能分子靶標(biāo)提供了證據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中腫瘤抑制因子P53 發(fā)生了突變或表達(dá)降低，但仍有約50%的腫瘤表達(dá)野生型的P53，而MDM2 通過(guò)泛素化途徑調(diào)節(jié)它的活性，使其發(fā)生降解，導(dǎo)致腫瘤的形成。抑制MDM2的表達(dá)，可以降低前列腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明MDM2 在前列腺癌生長(zhǎng)方面有重要作用[18-19]。抑制MDM2 與P53 的相互作用，成為治療腫瘤的新的策略。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，POT1 經(jīng)過(guò)蛋白酶體-泛素化途徑降解，與E3 泛素化連接酶MDM2 在細(xì)胞水平具有相互作用，但無(wú)論是高表達(dá)MDM2 還是敲除MDM2，POT1 的表達(dá)量都沒(méi)有明顯的變化，表明MDM2 不是POT1 的E3 泛素化連接酶或者不是POT1 的主要E3 泛素化連接酶。POT1 與MDM2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及診斷治療中都具有重要的作用，MDM2 與POT1 有明顯的相互作用，為研究POT1 與MDM2 其他的功能及腫瘤治療新的策略提供了重要依據(jù)。

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