阮崢，王文天，楊洋，段永娟，胡曉

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實驗血液學(xué)國家重點實驗室，天津 300020

慢病毒基因表達系統(tǒng)是目前廣泛使用的基因操作工具。該表達系統(tǒng)由用于表達特定基因的目的質(zhì)粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等組分的包裝質(zhì)粒組成，其中包裝質(zhì)粒提供了病毒基因組mRNA 包裝成完整毒粒所必需的結(jié)構(gòu)蛋白、聚合酶和包膜蛋白。獲得高滴度的病毒是后期開展基因功能研究的關(guān)鍵。在實際工作中，研究人員大多采用商業(yè)化的慢病毒包裝產(chǎn)品，或僅將各個包裝質(zhì)粒進行簡單混合，通常難以獲得針對所研究目的基因的最優(yōu)化的病毒包裝效率。Kumar 等[1]系統(tǒng)研究了不同慢病毒載體質(zhì)粒的包裝能力，發(fā)現(xiàn)隨著插入片段的延長，病毒滴度呈半對數(shù)形式下降，目的質(zhì)粒愈長則包裝活力毒粒的能力愈下降。當(dāng)研究的目的基因較大時，選擇優(yōu)化后的病毒包裝體系才可能得到高效率的病毒毒粒。然而，針對病毒包裝體系各組分以獲得高效病毒的研究尚為欠缺。我們利用目前廣泛應(yīng)用的三質(zhì)粒包裝體系，對慢病毒包裝時目的質(zhì)粒及各包裝質(zhì)粒的比例進行多個條件的包裝效率比較研究，初步分析了慢病毒包裝各組分的作用意義，著重比較了Rev表達質(zhì)粒對提高包裝病毒效率的作用，以期建立高效的可用于多種細胞感染的慢病毒包裝系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T 細胞與K562 細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）實驗血液學(xué)國家重點實驗室細胞庫提供（購自ATCC）；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自TIANGEN 公司；慢病毒包裝的目的質(zhì)粒pLVXEF1a-GFP-N1（pHEGP）購 自TaKaRa Clontech 公司；病毒包裝質(zhì)粒pLP1-gag/pol、pLP2-Rev和pLPVSVG購自Invitrogen公司。

IMDM、DMEM、OPTI-MEM 低血清培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清（FBS）和0.25%胰酶-EDTA 購自Gibco 公司；LipofectAMINE 2000 購自Invitrogen 公司；polybrene 購自Sigma 公司；質(zhì)粒提取試劑盒為QIAGEN Plasmid Mini Kit 及Maxi Kit；超速離心管購自Nalgene 公司；0.45μm 濾器購自Millipore 公司；低溫超高速離心機為Beckman Coulter 公司的Avanti J-30I；數(shù)字化分析型流式細胞儀為BD公司的LSRII。

1.2 細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒制備

293T 細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，當(dāng)細胞密度達到90%時經(jīng)0.25%胰酶-EDTA 消化傳代培養(yǎng)；K562 細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的IMDM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48～72 h 離心換液。復(fù)蘇實驗室保藏的pLVX-EF1a-GFP-N1（pHEGP）、pLP1、pLP2和pLP-VSVG等5 株大腸桿菌DH5α，振蕩培養(yǎng)過夜后用QIAGEN 大提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證正確。

1.3 慢病毒包裝

慢病毒包裝系統(tǒng)由目的質(zhì)粒、pLP1、pLP2和pLP-VSVG共4 種質(zhì)粒按一定比例組成，考慮到細胞對質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染存在飽和度，因此在控制總質(zhì)粒量不變的原則下（10μg/60 mm 中皿），同時改變2 個變量，考察2 個變量間的比例關(guān)系及重要性?；旌腺|(zhì)粒通過脂質(zhì)體（LipofectAMINE 2000）轉(zhuǎn)染293T 細胞，48 h 后收取含病毒粒子的上清，離心、過濾后置于4℃或-80℃保存。

1.4 病毒感染293T及K562細胞

感染前一天于6 孔板中接種5×105的293T 或K562 細胞，感染時加入1 mL 病毒上清（對照組為1 mL PBS）、1 mL DMEM 或IMDM 完全培養(yǎng)基及終濃度為8μg/mL 的polybrene，加入病毒后12 h 換液，3 d 后熒光鏡檢觀察GFP 熒光，并用流式細胞分析儀檢測GFP+細胞百分率，計算病毒感染陽性率。

2 結(jié)果

2.1 目的質(zhì)粒量是影響病毒包裝效率的首要因素

以采用不同質(zhì)粒比例進行病毒包裝獲得的病毒上清感染293T 細胞，由于目的質(zhì)粒表達GFP 熒光蛋白，因此感染后GFP 細胞陽性率可用于反映病毒的感染率差異。流式細胞檢測結(jié)果顯示，不同條件獲得的病毒上清感染293T 細胞的GFP 陽性率最低組僅11.5%，最高組可達66.8%，說明改變質(zhì)粒比例會顯著影響病毒包裝效率。

首先分析目的質(zhì)粒pHEGP與其余3個包裝質(zhì)粒對病毒包裝效率的影響。當(dāng)pLP1-gag/pol和pLPVSVG質(zhì)粒均為2.5μg 時，3.5μg pHEGP、1.5μg pLP2-Rev組比1.5μg pHEGP、3.5μg pLP2-Rev組細胞的陽性率提高到約3 倍（圖1）。在pHEGP 與pLP1-gag/pol以 及pHEGP 與pLP-VSVG的比較 中，同樣發(fā)現(xiàn)提高目的質(zhì)粒量同時遞減某一包裝質(zhì)粒量可顯著提升GFP 陽性率（數(shù)據(jù)未示）。以上結(jié)果說明，與幾個包裝質(zhì)粒相比較，目的質(zhì)粒的量是影響病毒包裝效率的首要因素。

2.2 不同包裝質(zhì)粒的重要性有差異，pLP2-Rev是影響病毒滴度的關(guān)鍵因素

明確目的質(zhì)粒量對病毒包裝效率的決定性地位后，進一步分析3 個包裝質(zhì)粒之間的重要性。將目的質(zhì)粒pHEGP 固定為3.5μg、3 個包裝質(zhì)?？偭慷?.5μg，分別依次提供低劑量（1.5μg）Rev、gag/pol和VSVG。當(dāng)提供低劑量VSVG質(zhì)粒時，病毒感染293T 細胞的GFP 細胞陽性率為66.8%；提供低劑量Rev質(zhì)粒時，GFP 細胞陽性率低至45.1%；提供低劑量gag/pol質(zhì)粒時，GFP 細胞陽性率居中為54.9%（圖2A）。說明Rev質(zhì)粒量對高效病毒包裝具有至關(guān)重要的作用。降低Rev劑量導(dǎo)致病毒包裝效率下降最為顯著，而減少VSVG用量仍可高效包裝病毒。將gag/pol和Rev與VSVG劑量間的相互作用進行對比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用低劑量VSVG時，增加Rev相對含量較增加gag/pol含量能更好地提升病毒滴度（圖2B）。

2.3 白血病細胞系K562 中再現(xiàn)包裝病毒的感染效率差異

圖1 比較目的質(zhì)粒量對病毒包裝效率的影響

血液細胞及干細胞通常較貼壁細胞的病毒感染效率低，因此對病毒的滴度更為敏感?；诓捎觅N壁的293T 細胞感染篩選優(yōu)化的病毒包裝條件，我們進一步利用白血病細胞系K562 細胞考察不同條件包裝病毒的感染效率。由流式細胞分析GFP陽性細胞的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），采用不同質(zhì)粒比例包裝的病毒在K562細胞中同樣導(dǎo)致差異的病毒感染率，并且分別改變Rev、gag/pol和VSVG表達質(zhì)粒的劑量均可取得與感染293T細胞相同趨勢的結(jié)果。

圖2 各包裝質(zhì)粒量對病毒包裝效率的影響

圖3 比較不同包裝條件獲得的病毒感染紅白血病惡性細胞系K562細胞的結(jié)果

表1 第三代慢病毒包裝系統(tǒng)用于不同研究中的質(zhì)粒比例

3 討論

基于HIV的慢病毒載體系已成為在哺乳動物細胞中研究基因功能的主流方法，但目前國內(nèi)外學(xué)者采用包裝系統(tǒng)中的質(zhì)粒比例卻不盡相同（表1）。大部分研究者在工作中僅采用商業(yè)化質(zhì)?；蚝唵伪壤旌?，尚未對慢病毒包裝系統(tǒng)各成分進行系統(tǒng)優(yōu)化，尤其是并未意識到pLP2-Rev的比例在病毒滴度提升中的重要性，因此本研究工作具有現(xiàn)實意義。

本研究表明目的質(zhì)粒量是影響病毒滴度的決定條件，并首次發(fā)現(xiàn)Rev 蛋白是影響有效毒粒的關(guān)鍵因素。Cochrane 等發(fā)現(xiàn)Rev 蛋白與病毒基因組mRNA上的特定序列RRE（Rev response element）元件結(jié)合形成穩(wěn)定的Rev-RNA 二級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對于基因組mRNA 的出核運輸具有關(guān)鍵作用[11]。該結(jié)合位點突變會導(dǎo)致Rev-RNA 結(jié)構(gòu)異常，進而擾亂病毒的核輸出。此外，BSA偶聯(lián)的Rev激活結(jié)構(gòu)域（BSAR）能夠顯性抑制Rev 介導(dǎo)的RNA 核輸出[12]?？梢奟ev蛋白對于形成完整長度的病毒基因組RNA 至關(guān)重要，病毒基因組RNA 的核輸出是保證完整病毒RNA 的關(guān)鍵步驟。這些觀點支持了我們的實驗結(jié)果——高比例的Rev 蛋白可顯著提高病毒的感染效率。高劑量Rev蛋白才能實現(xiàn)病毒基因組RNA的高效核輸出，避免其被細胞自身的防御系統(tǒng)降解。相對Rev 而言，gag/pol 的重要性次之，pLP1-gag/pol主要提供病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶特性，對于慢病毒活性毒粒必不可少。而VSVG 作為包膜蛋白，僅在細胞與病毒融合時發(fā)揮作用[13]，對于整個病毒的活性周期而言處于較次要的地位。綜上，我們得出了慢病毒包裝系統(tǒng)中4 個質(zhì)粒的相對優(yōu)先重要性等級，即目的質(zhì)粒＞Rev＞gag/pol＞VSVG。

已有的研究表明目的質(zhì)粒中插入片段長度與病毒滴度呈半對數(shù)形式負相關(guān)[1]，探索慢病毒包裝優(yōu)化體系應(yīng)選擇較長的目的質(zhì)粒作為實驗對象，因此實驗中選用了此前構(gòu)建的GFP 表達載體pHEGP。該載體在5'-LTR 與3'-LTR 間插入約2 kb 的片段，大小接近中等長度的基因插入片段。在此情況下進行病毒包裝效率的改進，可以更好地模擬實際基因功能研究中體系優(yōu)化的差異性。實驗中對病毒包裝效率的評價采用未經(jīng)濃縮的病毒上清，是基于兩方面的考慮，一方面排除超速離心或超速過濾過程中的干擾因素，另一方面排除高滴度濃縮病毒可能對感染率差異的掩蓋。

針對建立穩(wěn)定表達細胞系或難以進行普通轉(zhuǎn)染的實驗，通過慢病毒進行基因擾動是當(dāng)前基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的主流方法。慢病毒不僅具有高效率滴度，而且對于發(fā)育早期的多能干細胞，尤其是造血干細胞具有不可替代的優(yōu)勢。慢病毒包裝作為各大實驗室及公司的重要技術(shù)基礎(chǔ)，建立優(yōu)化包裝體系以提高長基因過表達效率非常重要。我們的實驗結(jié)果表明，相對低劑量的pLP-VSVG和相對高劑量的pLP2-Rev是優(yōu)化第三代慢病毒包裝體系的重點，這點在低MOI的293T 細胞系及較高MOI 的K562 細胞系中都得到驗證，為實現(xiàn)在血液細胞中相關(guān)基因的穩(wěn)定表達和后續(xù)功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]Kumar M,Keller B,Makalou N,et al.Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors[J].Human Gene Ther,2001,12(15):1893-1905.

[2]Chu C,Shatkin A J.Apoptosis and autophagy induction in mammalian cells by small interfering RNA knockdown of mRNA capping enzymes[J].Mol Cell Biol,2008,28(19):5829-5836.

[3]May T,Eccleston L,Herrmann S,et al.Bimodal and hysteretic expression in mammalian cells from a synthetic gene circuit[J].PloS One,2008,3(6):e2372.

[4]Ji L,Liu Y X,Yang C,et al.Self-renewal and pluripotency is maintained in human embryonic stem cells by co-culture with human fetal liver stromal cells expressing hypoxia inducible factor 1alpha[J].J Cell Physiol,2009,221(1):54-66.

[5]Hicks J K,Chute C L,Paulsen M T,et al.Differential roles for DNA polymerases eta,zeta,and REV1 in lesion bypass of intrastrand versus interstrand DNA cross-links[J].Mol Cell Biol,2010,30(5):1217-1230.

[6]Zhang J,Wang S,Yuan L,et al.Neuron-restrictive silencer factor(NRSF) represses cocaine-and amphetamine-regulated transcript(CART) transcription and antagonizes cAMP-response element-binding protein signaling through a dual NRSE mechanism[J].J Biol Chem,2012,287(51):42574-42587.

[7]Hillerdal V,Nilsson B,Carlsson B,et al.T cells engineered with a T cell receptor against the prostate antigen TARP specifically kill HLA-A2+prostate and breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(39):15877-15881.

[8]Chen J,Wang M,Guo M,et al.miR-127 regulates cell proliferation and senescence by targeting BCL6[J].PloS One,2013,8(11):e80266.

[9]Krasner N M,Ido Y,Ruderman N B,et al.Glucagon-like peptide-1(GLP-1) snalog liraglutide inhibits endothelial cell inflammation through a calcium and AMPK dependent mechanism[J].PloS One,2014,9(5):e97554.

[10]Zhang G,Wang L,Cui H,et al.Anti-melanoma activity of T cells redirected with a TCR-like chimeric antigen receptor[J].Sci Rep,2014,4:3571.

[11]Cochrane A W,Chen C H,Rosen C A.Specific interaction of the human immunodeficiency virus Rev protein with a structured region in the env mRNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(3):1198-1202.

[12]Fischer U,Huber J,Boelens W C,et al.The HIV-1 Rev activation domain is a nuclear export signal that accesses an export pathway used by specific cellular RNAs[J].Cell,1995,82(3):475-483.

[13]Emi N,Friedmann T,Yee J K.Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus[J].J Virol,1991,65(3):1202-1207.