趙麗艷，趙忠鵬，馬守棟，劉金鳳，李明春

1.解放軍第401醫(yī)院，山東 青島 266071；2.解放軍第305醫(yī)院，北京 100017

甲殼胺又稱殼聚糖、幾丁聚糖，主要是蝦、蟹等海洋甲殼綱類動物外殼的甲殼質(zhì)脫乙酰基后的產(chǎn)物，它由氨基葡萄糖經(jīng)β-1，4-糖苷鍵連接而成，是自然界天然多糖中惟一的堿性多糖，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、增強免疫力等多種藥理作用[1-4]。本實驗室的前期研究表明，甲殼胺能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞的凋亡[5]。為進(jìn)一步探討其作用機制，我們從蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)角度，動態(tài)監(jiān)測與細(xì)胞生長密切相關(guān)的膜相與胞漿蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性，并檢測相應(yīng)的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）的活性變化，探討甲殼胺在癌細(xì)胞內(nèi)的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌HepG2 細(xì)胞（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供）；水溶性甲殼胺（純度≥95%，脫乙?；省?5%，黏度＜200 mPa/s，濰坊海之源生物制品有限公司），用生理鹽水配制成儲備液，使用時用培養(yǎng)基配成所需濃度；RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；PBS 緩沖溶液（武漢博士德生物工程有限公司）；蛋白酶抑制劑（PMSF、aprotinin、leupeptin，Sigma-Aldrich 公司）；CB（E3）型培養(yǎng)箱（Binder 公司）；TGL16 型低溫高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）；Elx-800/808型酶標(biāo)儀（BIO-TEK 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

傳代HepG2 細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107/mL，加入甲殼胺儲備液，使終濃度為1.0 mg/mL，繼續(xù)于溫箱中培養(yǎng)，分別在不同時間準(zhǔn)確收集上述濃度的細(xì)胞液1 mL，做時間依賴曲線。對照組細(xì)胞在加藥前收集。

1.3 蛋白質(zhì)提取

細(xì)胞經(jīng)PBS 洗滌后，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿后于4℃、1200 r/min 離心10 min，收集上清液為總蛋白質(zhì)。細(xì)胞經(jīng)PBS 洗滌后，加入預(yù)冷的低滲裂解液，離心去沉淀，收集上清液為胞漿蛋白質(zhì)。收集低滲裂解液裂解細(xì)胞后經(jīng)離心得到的沉淀，再次加入裂解液作用30 min，再次勻漿離心后，收集上清液為膜相蛋白質(zhì)。

1.4 活性測定

采用生物素標(biāo)記的ELISA 法。蛋白樣本作用于激酶底物，使其酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，借助底物上標(biāo)記的生物素，與鏈親和素包被的酶標(biāo)板微孔結(jié)合；洗去未結(jié)合的底物，加入過氧化物酶標(biāo)記的特異性抗磷酸化酪氨酸殘基抗體，與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合；再洗去未結(jié)合的抗體，加入過氧化物酶的催化底物ABTS 進(jìn)行比色。測定波長405 nm，參考波長490 nm，通過PTK 活性-吸光度（D405nm-D490nm）的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，PTK 活性以酪氨酸磷酸肽的生成量表示。PTP 活性測定與PTK 相似，只是生物素標(biāo)記的磷酸酶底物中相應(yīng)的酪氨酸殘基是已磷酸化的，以（D對照-D測定）/D對照×100%來定量PTP的相對活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甲殼胺對總蛋白質(zhì)PTK活性的影響

如圖1，不同濃度的甲殼胺作用HepG2 細(xì)胞10 min 后，總蛋白質(zhì)的PTK 活性均受到抑制，且抑制效應(yīng)有一定的濃度依賴性，濃度越高，對總蛋白質(zhì)PTK的活性影響越大，濃度＞1.0 mg/mL 后，抑制率超過20%。經(jīng)t檢驗，各組濃度的甲殼胺對HepG2細(xì)胞總PTK活性均有不同程度的抑制作用（P＜0.05）。

2.2 甲殼胺作用于HepG2細(xì)胞后PTK活性的變化

選用濃度為1.0 mg/mL 的甲殼胺作用于HepG2細(xì)胞不同時間后測定PTK 活性，結(jié)果見圖2。隨作用時間的不同，不同蛋白質(zhì)樣品的PTK 活性發(fā)生了先降后升的動態(tài)變化。

2.3 不同濃度甲殼胺對總蛋白質(zhì)PTP活性的影響

不同濃度的甲殼胺作用于HepG2 細(xì)胞后，總蛋白質(zhì)的PTP活性測定結(jié)果如圖3。分析顯示，不同濃度的甲殼胺對HepG2細(xì)胞總蛋白質(zhì)PTP活性的影響無顯著性差異。

2.4 甲殼胺作用于HepG2 細(xì)胞后蛋白質(zhì)PTP 活性的變化

用1.0 mg/mL 的甲殼胺作用于HepG2 細(xì)胞不同時間，PTP活性呈先降后升的趨勢，如圖4，同時伴有PTP 的活性變化，可能反映了胞內(nèi)蛋白酪氨酸殘基的磷酸化與去磷酸化即時調(diào)節(jié)。

3 討論

HepG2 細(xì)胞的凋亡涉及多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6-8]，為深入研究甲殼胺誘導(dǎo)凋亡的機理，我們在多時間點檢測PTK 的活性，以反映其動態(tài)變化；同時檢測PTP 的活性變化，反映其體內(nèi)的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，不同濃度的甲殼胺對PTK 的活性均有抑制作用，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，表明甲殼胺可特異性地抑制PTK的活性。

圖1 不同濃度甲殼胺作用HepG2細(xì)胞30 min的磷酸肽-甲殼胺濃度曲線

圖2 1.0 mg/mL甲殼胺作用于HepG2細(xì)胞的磷酸肽-時間曲線

圖3 不同濃度甲殼胺作用于HepG2細(xì)胞后總蛋白質(zhì)PTP活性曲線

圖4 甲殼胺作用于HepG2細(xì)胞不同時間的PTP活性曲線

蛋白質(zhì)酪氨酸的可逆磷酸化是真核生物調(diào)控各種生理活動的重要機制，受作用相反的2 個酶即PTK（催化酪氨酸磷酸化）和PTP（催化酪氨酸脫磷酸化）的調(diào)節(jié)[9]。真核生物細(xì)胞通過這種可逆的平衡來調(diào)節(jié)細(xì)胞間與細(xì)胞內(nèi)的通信，參與細(xì)胞的生長發(fā)育、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與免疫等。實驗發(fā)現(xiàn)，HepG2 細(xì)胞經(jīng)一定濃度的甲殼胺處理后，總蛋白質(zhì)、胞漿蛋白質(zhì)、膜相蛋白質(zhì)中的PTK 活性均有短暫下降，隨后恢復(fù)正常。從下降的時相看，膜相蛋白質(zhì)中的PTK 活性變化先于胞漿蛋白質(zhì)中的PTK 活性變化，提示可能存在一個由外而內(nèi)的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。甲殼胺對分布不同的PTK 均有抑制作用，推測與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，但因為膜蛋白的提取過程變性作用更強，可能導(dǎo)致酶活性的下降。而且，由于PTP類型眾多，其確認(rèn)的家族成員已超過100 個，究竟具體哪些酶在甲殼胺誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用、是否存在特異性受體型蛋白酶等，還有待深入研究。

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