趙炳芬

(勝利油田 中心醫(yī)院 腫瘤科， 山東 東營 257034)

研究論文

RGD和細(xì)胞穿膜肽共修飾脂質(zhì)體的構(gòu)建及其體外功能評價

趙炳芬*

(勝利油田 中心醫(yī)院 腫瘤科， 山東 東營 257034)

目的制備RGD和TAT共修飾載紫杉醇(PTX)脂質(zhì)體(RGD/TAT-LP-PTX)，研究其理化性質(zhì)和體外抗腫瘤作用。方法薄膜分散法制備RGD/TAT-LP-PTX，研究其理化性質(zhì)；檢測肝癌HepG2細(xì)胞對RGD/TAT-LP的攝取效率以及脂質(zhì)體的攝取機(jī)制。共聚焦實驗研究腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取。MTT檢測RGD/TAT-LP-PTX對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果RGD/TAT-LP-PTX的粒徑134.5±8.4 nm，電位為22.35±2.55 mV，紫杉醇的包封率84.6%。RGD/TAT-LP在4 h攝取效率是2 h的1.65倍(P< 0.05)；HepG2細(xì)胞在4 h對RGD/TAT-LP的攝取效率分別是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P< 0.01)；RGD/TAT-LP-PTX在24 h HepG2細(xì)胞的存活率是48 h的1.75倍(P< 0.05)；給藥48 h后，TAT-LP-PTX、RGD -LP-PTX和LP-PTX的細(xì)胞存活率分別是RGD/TAT-LP-PTX組的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P< 0.01)。結(jié)論RGD和TAT共修飾紫杉醇脂質(zhì)體是一種潛在高效的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。

整合素受體；細(xì)胞穿膜肽；脂質(zhì)體；腫瘤靶向

在過去幾十年，隨著現(xiàn)代生物研究的進(jìn)展，對腫瘤疾病的治療手段日益豐富。其中腫瘤的靶向治療成為了腫瘤治療研究的熱點[1]。脂質(zhì)體是最常用的一種靶向給藥載體，具有良好的生物相容性，可表面修飾實現(xiàn)主動靶向[2]。TAT作為一種強(qiáng)效的細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)被廣泛應(yīng)用于納米載體的研發(fā)中，以提高納米載體的入胞能力[3]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞表面有整合素受體高度表達(dá)[4]。本研究以脂質(zhì)體為載體，制備了RGD和細(xì)胞穿膜肽共修飾紫杉醇脂質(zhì)體，并對其理化性質(zhì)和體外活性進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆磷脂(SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司)；膽固醇(Chol，Sigma公司)；DSPE-PEG2000和FITC標(biāo)記的磷脂(Avanti polar lipids公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；其余試劑為分析純。人源肝癌細(xì)胞(HepG2，ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 肝癌HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)：將HepG2細(xì)胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2，飽和濕度，溫度為37 ℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5 mg/L胰蛋白酶消化傳代，取增殖期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 RGD/TAT-LP-PTX的制備及其表征:參照文獻(xiàn)[5- 6]方法合成DSPE-PEG2000-RGD和DSPE-PEG2000-TAT。將處方量的紫杉醇，SPC，Cho，DSPE-PEG3500-RGD，DSPE-PEG2000-TAT，DSPE-PEG-OMe(保證總磷脂∶膽固醇=75∶25(摩爾比)，分別溶于三氯甲烷，置50 mL茄形瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后，真空干燥器中過夜。加入2.5 mL PBS緩沖液(pH 7.4)，置空氣浴搖床中，37 ℃，180 r/min，20 min水化，水浴超聲5 min脫膜，探頭超聲制備得到RGD與TAT共修飾的紫杉醇脂質(zhì)體或者FITC標(biāo)記脂質(zhì)體。

采用葡萄糖凝膠柱色譜法分離脂質(zhì)體與未包載的紫杉醇，將過柱后的脂質(zhì)體采用triton-100破乳，用HPLC法在227 nm檢測紫杉醇含量。按照EE%=W包/W投×100%計算包封率。W包：脂質(zhì)體中包載的藥物量。W投：制備脂質(zhì)體的投藥量。

1.2.3 RGD/TAT-LP-PTX的血清穩(wěn)定性:取脂質(zhì)體樣品500 μL，每個樣品3份。分別與等體積的磷酸鹽緩沖液、含有50%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液混合，于37 ℃下孵育1、4、8、12和24 h，分別測定其在750 nm的透光率。以樣品在磷酸鹽緩沖液中的透光率值為空白，以樣品在含有50%FBS的磷酸鹽緩沖液中的透光率與其在磷酸鹽緩沖液中透光率的比值來評價納米粒在血清中的穩(wěn)定性。

1.2.4 HepG2細(xì)胞對FITC標(biāo)記脂質(zhì)體的攝取及攝取機(jī)制：將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量FITC標(biāo)記的LP、TAT-LP、RGD-LP和RGD/TAT-LP，使孔中脂質(zhì)體為0.20 μg/mL，37 ℃分別孵育2和4 h后除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)基，冷PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化后離心，PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞熒光值。

為了定性觀察細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取，將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2 μg/mL 4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽溶液，室溫孵育20 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，置激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取。

為了檢測脂質(zhì)體的攝取機(jī)制，將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量FITC標(biāo)記的LP、TAT-LP、RGD-LP和RGD/TAT-LP，使孔中脂質(zhì)體為0.20 μg/mL，分別控制溫度、多聚賴氨酸以及不同胞吞抑制劑孵育4 h后，流式細(xì)胞儀測定熒光值。

1.2.5 MTT檢測不同脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入無菌過濾后的脂質(zhì)體，使每孔為6.5 μmol/mL。將孔板移入37 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24和48 h后取出，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃避光振搖15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的吸光度(A)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的表征

取適量脂質(zhì)體用磷鎢酸染色，采用透射電鏡(TEM)觀察形態(tài)(圖1)，制備的脂質(zhì)體成球狀，形態(tài)均一。紫杉醇的包封率為84.6%，粒徑和電位(表1)。

圖1 RGD/TAT-LP-PTX的透射電鏡照片F(xiàn)ig 1 Transmission electron microscopy image of the RGD/TAT-LP-PTX(×10 000)

formulationsize/nmPDIzeta?potential/mVLP988±540130±0050-252±356RGD?LP1119±1040120±0030 282±216TAT?LP1155±980110±00602182±313RGD/TAT?LP1345±840140±00502235±255

2.2 脂質(zhì)體的血清穩(wěn)定性

各組脂質(zhì)體在50%的血清中的透光率與其在PBS中的透光率的比值均大于90%，表明4種脂質(zhì)體24 h在血清中均具有較好的穩(wěn)定性(表2)。

2.3 HepG2細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取和攝取機(jī)制

RGD/TAT-LP在4 h攝取效率是2 h的1.65倍(P< 0.05)(圖2)。肝癌HepG2細(xì)胞在與脂質(zhì)體共同孵育4 h后對RGD/TAT-LP的攝取效率分別是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P< 0.01)；RGD/TAT-LP組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于其他組(圖3)。4 ℃條件下，RGD/TAT-LP的攝取下降88%，NaN3使脂質(zhì)體的攝取下降19%。多聚賴氨酸使脂質(zhì)體的攝取下降55%。秋水仙素和氯丙嗪分別使脂質(zhì)體的攝取下降15%和45% (圖4)。

*P< 0.01 compared with RGD/TAT-LP at 2 hours;#P< 0.01 compared with RGD-LP,TAT-LP and LP圖2 HepG2細(xì)胞不同時間對不同脂質(zhì)體的攝取效率Fig 2 Uptake of different liposomes by HepG2 cells

2.4 不同脂質(zhì)體抑制HepG2細(xì)胞的增殖

RGD/TAT-LP-PTX對肝癌HEPG2細(xì)胞的增殖抑制率隨著時間的延長而增長，RGD/TAT-LP-PTX在24 h肝癌HepG2細(xì)胞的存活率是48 h的1.75倍(P< 0.01)；在給藥48 h后，TAT-LP-PTX、RGD-LP-PTX和LP-PTX的細(xì)胞存活率分別是RGD/TAT-LP-PTX組的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P< 0.01)(圖5)。

表2 不同脂質(zhì)體在50% FBS中的透光率變化Table 2 The transmittancy variation of liposomes in 50% FBS

圖3 激光共聚焦觀察HepG2細(xì)胞對FITC標(biāo)記脂質(zhì)體的攝取Fig 3 Uptake of FITC labelled liposomes by HepG2 cells based on confocal laser scanning microscopy(×2 000)

*P< 0.05 compared with PBS group圖4 各種抑制劑對HepG2細(xì)胞攝取的影響Fig 4 Effect of endoeytosis inhibitors on the celluar uptake of liposomes in HepG2 cells

*P< 0.01 compared with saline group； #P< 0.01compared with RGD-LP-PTX and TAT-LP-PTX圖5 HepG2細(xì)胞在不同脂質(zhì)體MTT實驗中的存活率Fig 5 HepG2cell viability at various drugs at 24 and 48 hours after the treatment

3 討論

細(xì)胞穿膜肽TAT能夠穿過與之相接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜，而對細(xì)胞膜沒有損傷[7]。TAT修飾的脂質(zhì)體用于腫瘤靶向給藥已經(jīng)被廣泛研究，然而其缺乏選擇性也限制了TAT在全身系統(tǒng)給藥中的應(yīng)用[3]。整合素αvβ3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和肝癌等多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)，因此整合素αvβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點[8]。有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)的三肽序列能夠特異性地識別含αv亞基的整合素家族，具有高度親和力。本研究制備的脂質(zhì)體通過EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位，再通過RGD識別高度表達(dá)整合素受體的腫瘤細(xì)胞，與細(xì)胞結(jié)合，通過穿膜肽TAT的高效穿膜作用，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

本研究制備得到的共修飾脂質(zhì)體的粒徑為130 nm左右，有研究顯示，納米載體的粒徑范圍在10～150 nm能夠有效避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，通過實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)到達(dá)腫瘤組織[2]。在細(xì)胞攝取實驗中，與普通脂質(zhì)體相比，經(jīng)過RGD或者TAT修飾都能夠顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取，其中對共修飾脂質(zhì)體的攝取效率顯著高于RGD或者TAT單獨(dú)修飾的脂質(zhì)體，這說明二者發(fā)揮了協(xié)同作用，共同促進(jìn)入胞。載藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性以及釋藥能力等與其細(xì)胞攝取途徑密不可分，不同配體修飾載體產(chǎn)生的攝取機(jī)制不同，因此本研究考察了溫度、能力抑制劑NaN3、多聚賴氨酸以及各種胞吞抑制劑對RGD/TAT-LP在HepG2細(xì)胞中攝取的影響，從而研究修飾脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取機(jī)制。結(jié)果顯示，RGD/TAT-LP的入胞依賴巨胞飲和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的溫度、電荷以及能量依賴的過程。通過腫瘤細(xì)胞增殖抑制實驗證實經(jīng)過雙配體修飾后脂質(zhì)體能夠增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力，這與細(xì)胞攝取的實驗結(jié)果相一致，這說明脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性依賴于腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取效率。綜上所述，RGD/TAT-LP是一種潛在高效的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。

[1] Qin Y,Chen H, Zhang Q,etal. Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeutic efficacy on brain glioma in animals[J]. Int J Pharm, 2011, 420:304- 312.

[2] Zhang L, Zhang LF. Lipid-polymer hybrid nanoparticles: synthesis, characterization and applications[J]. Nano LIFE, 2010, 1: 163- 173.

[3] Khalil IA, Kogure K, Futaki S,etal. Octaarginine-modified liposomes: Enhanced cellular uptake and controlled intracellular trafficking[J].Int J Pharm,2008,354:39- 48.

[4] Oba M, Fukushima S, Kanayama N,etal. Cyclic RGD peptide-conjugated polyplex micelles as atargetable gene delivery system directed to cells possessing αvβ3 and αvβ5 integrins[J]. BioconjugChem, 2007, 18:1415- 1423.

[5] Kuai R, Yuan W, Qin Y,etal. Efficient Delivery of Payload into Tumor Cells in a Controlled Manner by TAT and Thiolytic Cleavable PEG Co-Modified Liposomes[J]. Mol. Pharmaceutics, 2010,7:1816- 1826.

[6] Zhang Q, Tang J, Fu L,etal. A pH-responsive a-helical cell penetrating peptide-mediated liposomal delivery system[J].Biomaterials,2013,34:7980- 7993.

[7] Qin Y, Chen H, Yuan W,etal.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for enhancing the brain delivery[J].Int J Pharm,2011,419:85- 95.

[8] Ying X, Wen H, Lu WL,etal. Dual-targeting daunorubicin liposomes improve the therapeutic efficacy of brain glioma in animals[J].J Controlled Release,2010,141:183- 192.

The preparation and characterization of RGD and the function ofcell penetrating peptides co-modified paclitaxel loaded liposomeinvitro

ZHAO Bing-fen*

(Dept. of Oncology，Shengli Oilfield Central Hospital，Dongying 257034, China)

ObjectiveTo prepare RGD and TAT co-modified paclitaxel loaded liposome(RGD/TAT-LP-PTX)for HepG2cells targeting.MethodsThe co-modified liposome was prepared by film-ultrasonic method. The appearance，particle size，Zeta potential were evaluated. The cellular uptake by HepG2cellsinvitrowas used to evaluate the targeting efficiency. The anti-proliferation efficiency of RGD/TAT-LP-PTX was evaluated by MTT assay.ResultsThe particle diameter of the co-modified liposome was 134.5±8.4 nm with the Zeta potential of 22.35±2.55mV. The entrapment efficiency of PTX was 84.6%. The result demonstrated that the co-modified liposome uptakes by HepG2 were 2.2, 2.7 times higher than that of TAT-LP and RGD-LP, respectively.The MTT assay demonstrated that the cell viability of TAT-LP-PTX，RGD-LP-PTX and LP-PTX were 1.65, 1.74 and 2.1 times higher than that of RGD/TAT-LP-PTX respectively.ConclusionsThe co-modified liposome may function as a promising tumor delivery system of antitumor drugs.

integrin receptor；cell penetrating peptides；liposomes；tumor targeting

2013- 12- 24

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)：527236911@qq.com

1001-6325(2014)08-1083-05

R 735.7

A