魏 華，王 明，劉瑞敏，張 天，馬 瑾，馬遠方*，齊義軍*

(河南大學 1.醫(yī)學院 細胞與分子免疫學重點實驗室；2.淮河醫(yī)院 內(nèi)窺鏡室，河南 開封 475004)

研究論文

食管鱗癌中14-3-3σ表達的臨床意義及與預(yù)后的相關(guān)性

魏 華1,2，王 明1，劉瑞敏1，張 天1，馬 瑾1，馬遠方1*，齊義軍1*

(河南大學 1.醫(yī)學院 細胞與分子免疫學重點實驗室；2.淮河醫(yī)院 內(nèi)窺鏡室，河南 開封 475004)

目的確定14-3-3σ與食管鱗狀細胞癌(ESCC)臨床病理特征及與預(yù)后的相關(guān)性。方法-86 ℃凍存的TNM Ⅰ～Ⅳ期ESCC 80例，ESCC組織芯片含ESCC 86例；分別應(yīng)用Western blot、免疫組織化學檢測80例凍存、組織芯片中86例ESCC中14-3-3σ的表達；Kaplan-Meier分析14-3-3σ、臨床病理資料與ESCC術(shù)后整體生存期相關(guān)性。結(jié)果14-3-3σ蛋白主要表達于胞質(zhì)及胞膜，其陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈負相關(guān)，與分化程度正相關(guān)(P< 0.05)；14-3-3σ高表達及低表達ESCC患者術(shù)后平均生存時間分別為39.82和28.45個月，5年整體生存率分別為43.31%和24.8%(log-rank test,P<0.01)，TNM分期和14-3-3σ是影響ESCC預(yù)后的獨立因素。結(jié)論14-3-3σ低/失表達可能是ESCC預(yù)后不良的分子標志物之一。

食管鱗狀細胞癌；14-3-3σ；生物標志物；預(yù)后

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界上八大常見的惡性腫瘤之一[1]。在中國，EC的主要組織學類型為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，約占所有EC的90%[2]。近20年來，盡管EC的臨床治療手段不斷改善，但術(shù)后EC的預(yù)后仍然很差，5年整體生存率為15%～34%[3]，而早期EC患者術(shù)后的5年整體生存率可達到90%[4]。因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高食管癌治愈率的關(guān)鍵因素之一。

14-3-3蛋白家族中，14-3-3σ與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系最為密切，是候選抑癌基因之一，其異常表達見于人類多種腫瘤[5]。本研究采用Western blot和免疫組織化學技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)檢測14-3-3σ在不同臨床分期ESCC中的表達規(guī)律，探討14-3-3σ與ESCC患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

80例(每期20例)TNMⅠ-Ⅳ期ESCC及配對手術(shù)切緣組織來源于林州市腫瘤醫(yī)院，組織離體后立即置于液氮或-86 ℃冰箱保存(獲知情同意書)。ESCC組織芯片(上海芯超生物科技有限公司, HEso-Squ172Sur-01)包含86例，臨床病理資料見表1。鼠抗人14-3-3σ抗體(SC-100638)和生物素標記山羊抗鼠二抗(P0447)(Santa Cruz公司)(Dako公司)。

1.2 Western blot

應(yīng)用組織裂解液(8 mol/L尿素, 4 %3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸水合物, 40 mmol/L的DTT)提取組織蛋白，BSA法測蛋白濃度，40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗孵育過夜(1∶5 000)，二抗室溫孵育1 h (1∶10 000)，加ECL后暗室顯影，ImageScanner掃描Western blot圖像，Quantity One軟件進行半定量分析。

1.3 IHC及評分

IHC采用ABC法。IHC染色強度分為陰性(0)、弱陽性(1)、中度陽性(2)和強陽性(3)；陽性細胞數(shù)分為<10%(0)、10%～25%(1)、25%～50%(2)、50%～75%(3)和>75%(4)。IHC染色強度和陽性細胞之積為IHC綜合評分(1～12)。

1.4 統(tǒng)計學分析

SPSS17.0分析軟件進行統(tǒng)計學處理，各組間的分析采用t檢驗，ESCC患者生存分析采用Kaplan-Meier曲線和log-rank test檢驗，平均隨訪時間為42.3±6.5個月，中位生存時間是27.9±4.7個月。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期ESCC中14-3-3σ的表達

14-3-3σ在ESCC中的表達顯著低于切緣正常食管黏膜組織，隨著臨床分期的進展，ESCC組織中14-3-3σ表達降低更加顯著，而切緣組織中14-3-3σ的表達與此相反 (P< 0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with TNM-Ⅰ圖1 Western blot顯示TNM Ⅰ～Ⅳ期ESCC中14-3-3σ表達;Fig 1 Western blot shows 14-3-3σ protein expression in ESCC of TNM Ⅰ～Ⅳ stage

A.well-differention; B.moderate-differention; C.poor-differention圖2 免疫組化顯示ESCC中14-3-3σ表達；Fig 2 Immunohistochemistry shows 14-3-3σ protein expression in ESCC(×200)

2.2 14-3-3σ表達與臨床病特征的相關(guān)性

14-3-3σ免疫陽性反應(yīng)主要位于胞質(zhì)及胞膜，呈淡黃色至棕黃色。在高、中和低分化的ESCC中14-3-3σ蛋白陽性表達的百分率分別為66.7%、41.3%和24%(圖2)；與高分化相比，中、低分化ESCC中14-3-3σ表達顯著下降(P< 0.05)；14-3-3σ蛋白表達還與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負相關(guān)(P< 0.05)，而與ESCC患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤侵襲深度無顯著相關(guān)性(表1)。

表1 14-3-3σ蛋白表達與ESCC臨床病理特征相關(guān)性

*IndicatesP<0.05.

2.3 14-3-3σ與ESCC患者術(shù)后生存期相關(guān)性

86例ESCC患者術(shù)后的5年整體生存率為28.7%；14-3-3σ高表達ESCC患者(24例)的術(shù)后生存時間(39.82月)長于低表達或失表達的ESCC患者(62例，28.45月)，14-3-3σ高表達及低表達ESCC患者的5年整體生存期分別為43.31%及24.8%(P< 0.01)。此外，ESCC患者術(shù)后的生存期還與性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

2.4 Cox比例風險回歸模型分析

應(yīng)用Cox單因素比例風險回歸模型分析14-3-3σ和臨床病理資料對ESCC術(shù)后生存期的影響，發(fā)現(xiàn)性別、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、14-3-3σ是影響ESCC預(yù)后的重要因素(P< 0.05)(表2)。Cox多因素比例風險回歸模型的分析表明： TNM分期和14-3-3σ是影響ESCC預(yù)后的獨立因素(P< 0.05)(表2)。

3 討論

14-3-3σ能導(dǎo)致細胞周期G2/M期阻滯，允許受損DNA進行修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定性。因而，14-3-3σ具有腫瘤抑制功能，其低表達見于多種腫瘤，如乳腺癌[6]、肝癌[7]、前列腺癌[8]、和鼻咽癌[9]等。14-3-3σ過度表達能夠明顯抑制鼻咽癌細胞增殖、非依賴性生長和荷瘤裸鼠體內(nèi)的鼻咽癌細胞生長[10]。中國ESCC中14-3-3σ表達主要定位于細胞質(zhì)，14-3-3σ低/失表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著正相關(guān)，與ESCC分化程度呈負相關(guān)[11]；而日本ESCC(248例) 中胞核內(nèi)14-3-3σ高表達與腫瘤浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)[12]。與此類似，肺癌、結(jié)腸癌和卵巢腫瘤中14-3-3σ的表達模式也不一致。多數(shù)的卵巢透明細胞癌中14-3-3σ表達缺失，而89.5%漿液性卵巢癌、90%子宮內(nèi)膜樣卵巢癌、81.8%黏液性卵巢癌中14-3-3σ的表達增高[13]；未轉(zhuǎn)移的卵巢癌中14-3-3σ表達缺失、或中至強陽性表達，而發(fā)生鄰近器官轉(zhuǎn)移的卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶內(nèi)14-3-3σ的表達均為強陽性[14]。導(dǎo)致相同組織/器官起源的腫瘤中14-3-3σ表達模式不一致的具體機制尚不十分清楚，可能與地區(qū)、遺傳、環(huán)境、組織學類型、組織處理和腫瘤分期等因素有關(guān)。

表2 Cox單因素和多因素風險比例模型分析各變量與ESCC預(yù)后關(guān)系

*IndicatesP<0.05.

目前臨床普遍采用的食管癌TNM分期系統(tǒng)具有一定局限性，導(dǎo)致同一TNM分期的ESCC患者預(yù)后不一致；此外，僅50%的腫瘤患者對目前臨床上常用的放化療敏感[15]。因而，需要建立ESCC預(yù)后的分子分型系統(tǒng)，為ESCC的臨床治療提供理論依據(jù)。本研究表明，14-3-3σ低/失表達ESCC患者的5年整體生存率(24.8%)顯著低于14-3-3σ高表達ESCC患者(43.31%)；14-3-3σ是ESCC預(yù)后的獨立影響因素之一。148例中國ESCC中14-3-3σ表達與預(yù)后的相關(guān)性，與本研究結(jié)果一致[12]；而日本ESCC胞核中14-3-3σ高表達與ESCC預(yù)后呈負相關(guān)[12]。不僅如此，其他腫瘤也有類似完全相反的結(jié)果，提示不同組織起源的腫瘤或相同組織起源但來源不同的腫瘤中14-3-3σ的功能不一，從而導(dǎo)致14-3-3σ表達模式與腫瘤患者預(yù)后存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3σ表達與TNM分期和ESCC預(yù)后呈顯著負相關(guān)，并且14-3-3σ是影響ESCC預(yù)后的獨立因素，表明14-3-3σ表達失調(diào)是ESCC惡性演進過程中的重要分子事件，為ESCC分子分型及預(yù)后評估奠定了理論基礎(chǔ)。

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Clinical relevance and correlation with prognosis of14-3-3σ expression in esophageal squamous cell carcinoma

WEI Hua1,2, WANG Ming1, LIU Rui-min1, ZHANG Tian1, MA Jin1, MA Yuan-fang1*, QI Yi-jun1*

(1.Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, College of Medicine, Henan University;2.Dept. of Endoscopy, Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475004, China)

ObjectiveThis study aims to determine the correlation of 14-3-3σ expression with clinical features and its prognostic value in ESCC.MethodsEighty frozen ESCC samples of TNMⅠ to Ⅳ stage stored at -86 ℃ and a tissue microarray containing 86 fixed ESCC samples were used. Western blot was used to examine the 14-3-3σ protein expression in frozen ESCC, and IHC to estimate the 14-3-3σ protein expression in 86 ESCC samples from tissue microarray. The association of 14-3-3σ protein expression with clinical features and ESCC prognosis was determined by Kaplan-Meier curves.Results14-3-3σ immunostaining was located predominantly in the cytoplasm and plasma membrane. 14-3-3σ was positively correlated with differentiation, and negatively with lymph node metastasis and TNM stage(P< 0.05). The average survival time of ESCC patients with 14-3-3σ high and low expression was 39.82 months and 28.45 months, respectively, and the overall 5 year survival rate were 43.31% and 24.8%, respectively (log-rank test, P< 0.01). TNM stage and 14-3-3σ were independent prognostic factors of ESCC.ConclusionsLow/loss protein expression of 14-3-3σ may correlate with poor prognosis of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma; 14-3-3σ; biomarker; prognosis

2014- 03- 24

2014- 05- 30

國家自然科學基金(81072039)

*通信作者(correspondingauthor)：qiyijun@hotmail.com； mayf@henu.edu.cn

1001-6325(2014)08-1044-05

R 735.7

A