李娜娜 王冬梅 杜東穎 秦運杰 夏平安 楊明凡 崔保安

(河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院獸醫(yī)微生物實驗室，鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是二十世紀八十年代末發(fā)現(xiàn)的一種高度傳染性疾病，引起妊娠母豬的流產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道疾病［1］。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，單股正鏈RNA病毒，大小約15 kb，編碼9個開放閱讀框［2］。PRRSV有嚴格的組織嗜性，只感染血液中PAM(Pulmonary alveolar macrophages)細胞和單核細胞，能夠在宿主體內自主復制［3-6］。在體外可感染非洲綠猴腎細胞系如Marc-145細胞、骨髓來源樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)、單核細胞源性巨噬細胞(Monocyte-derived macrophages，MDM)［7-9］。巨噬細胞和樹突狀細胞在免疫應答中發(fā)揮著重要作用，能夠產生大量的細胞因子。許多研究資料表明，PRRSV感染宿主后抗病毒細胞因子水平下調［8，10］。豬感染 PRRSV后機體快速調動其體液免疫，但是早期亞中和抗體和非中和抗體通過ADE(Antibody-dependent enhancement)作用嚴重影響PRRS的發(fā)展，使病毒更容易通過IgG Fc受體(FcγR)介導的細胞吞噬作用被單核細胞、巨噬細胞吸附和內吞，從而進入宿主細胞內［11-15］。

IgG Fc受體屬于IgG基因超家族成員，是免疫應答中重要的膜性調節(jié)分子，主要表達于NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞等，主要是通過與配體結合來發(fā)揮某些重要的生物學效應，例如參與抗原的處理和遞呈，抗體依賴性細胞毒作用(Antibody dependent cytotoxicity ，ADCC)，細胞因子的產生，免疫應答反應和信號轉導等免疫識別與清除作用［16］。根據配體的特異性可分為 IgG受體(FcγR)、IgA 受體(FcaR)、IgE 受體(FcεR)、IgM 受體(FcμR)和 IgD 受體(FcδR)。目前鑒定的 FcγR有 FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、boFcγRⅡ和 moFcγRⅣ等五個亞類［17］。其中 FcγRⅢ(CD16)含有 2個 Ig樣胞外區(qū)結構域，為中低親和力受體，是唯一在NK細胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體［18］。本實驗室成功地從豬PAM細胞克隆出FcγRⅢ(CD16)并制備其多克隆抗體［19］，為本實驗奠定基礎。

本試驗通過研究FcγRⅢ的選擇性激活對在宿主細胞的抗病毒因子水平的影響，來研究在PRRSV感染過程中的FcγRⅢ介導的免疫反應作用。

1 材料與方法

1.1 毒株、抗體與實驗動物 PRRSV Hn-1/06株(TCID50為10－4.6/0.1 ml)為本實驗室分離并保存;純化鼠抗豬 FcγRⅢ IgG(ELISA檢測抗體效價1∶12 800)由本實驗室制備并保存;PRRSV抗原、抗體均為陰性的20日齡健康大白仔豬，購自鄭州某豬場。

1.2 主要試劑 Reverse Transcriptase M-MLV、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、SYBR Premix Ex Taq等購自TaKaRa公司;LPS購于Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基干粉購自Gibco公司;新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 PAM細胞的制備 按照徐紅運等［20］的方法獲取PAM細胞，重懸于10%血清的RPMI1640中。調整細胞濃度至5×106個/ml，加入24孔細胞培養(yǎng)板，0.5 ml/孔，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6 h，棄去未貼壁的細胞，用 PBS液洗板一次，加入10%血清 RPMI1640營養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。

1.3.2 PRRSV感染PAM試驗 將含有200個TCID50的PRRSV 接種 PAM 細胞，感染12、24、36、48、60、72 h 后分別收集細胞培養(yǎng)液，用段二珍［21］建立的Real-time qPCR方法檢測感染不同時間段PAM細胞中PRRSV的拷貝數(shù)(絕對定量);用張宜娜［22］建立的Real-time qPCR方法檢測不同時間段PAM細胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平(相對定量)。同時設對照細胞組。

1.3.3 LPS刺激PAM細胞試驗 將終濃度100 ng/ml LPS［23］接種 PAM 細胞，作用 12、24、36、48、60、72 h后分別收集細胞培養(yǎng)液，用張宜娜建立的Real-time qPCR方法分別檢測不同時間段PAM細胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 轉錄水平。

1.3.4 FcγRⅢ對PAM細胞中細胞因子轉錄水平影響試驗 將純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接種到 PAM 細胞上，200 μl/孔，置 37℃、5%CO2條件下作用1 h，取出細胞培養(yǎng)板，棄去上清液。每孔加入 500 μl 10%血清 RPMI1640 營養(yǎng)液，12、24、36、48、60、72 h后分別收集細胞培養(yǎng)液，用張宜娜建立的Real-time qPCR方法檢測不同時間段PAM細胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 轉錄水平。

1.3.5 FcγRⅢ的選擇性激活試驗 將純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接種到 PAM 細胞上，200 μl/孔，置 37℃、5%CO2條件下作用 1 h，取出細胞培養(yǎng)板，棄去上清液。然后將含有200個TCID50的PRRSV接種處理的 PAM細胞上，感染 12、24、36、48、60、72 h 后分別收集細胞培養(yǎng)液，檢測方法同1.3.2。

1.3.6 數(shù)據處理方法 每個檢測樣品做3個平行，絕對定量所得結果，即PRRSV拷貝數(shù)，用建立的標準曲線進行計算。相對定量所得結果用2－ΔCT法進行比較，即ΔCT=CT目的基因-CT持家基因。以 β-actin為持家基因。用 GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據處理。

2 結果

2.1 PRRSV在PAM細胞中的增殖規(guī)律 如圖1所示PRRSV感染PAM細胞后，48 h PRRSV的拷貝數(shù)最高可達到1.34E+06，之后PRRSV的拷貝數(shù)下降。

2.2 PRRSV對PAM細胞中抗病毒細胞因子轉錄水平的影響 應用實時熒光定量PCR方法檢測PRRV、LPS誘導PAM細胞和未處理對照組PAM細胞在 12、24、36、48、60、72 h 后 IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平的變化，確定PRRSV引起宿主細胞的先天抗病毒反應。如圖2顯示，LPS處理組IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平與對照組細胞相比均上調。接種病毒組IFN-α mRNA轉錄水平在PRRSV感染PAM細胞12、24 h后與對照組細胞相比顯著上調，分別上調1.46倍和1.35倍，感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA轉錄水平下降，分別是其0.71倍、0.78倍、0.70倍、72 h后恢復對照組細胞水平。TNF-α mRNA 轉錄水平在 PRRSV 感染12、24、36、48、60、72 h后均高于對照組細胞，達1.15～2.49倍，在48 h后差異最大，達到2.49倍。

2.3 FcγRⅢ對PAM細胞中抗病毒細胞因子轉錄水平的影響 為研究FcγRⅢ引起宿主細胞的先天抗病毒反應，用純化的鼠抗豬FcγRⅢIgG選擇性激活 PAM 細胞 FcγRⅢ受體，在 12、24、36、48、60、72 h后檢測IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平的變化。如圖3 顯示，選擇性激活豬 FcγRⅢ后 IFN-α、TNF-α mRNA 轉錄水平在 12、24、36、48、60、72 h 均顯著低于對照組細胞，與對照組細胞相比，IFN-α mRNA轉錄水平是其0.21～0.26倍，在24 h最低;TNF-α mRNA轉錄水平是其0.15～0.31倍，在36 h最低，這些數(shù)據表明選擇性激活FcγRⅢ能夠抑制宿主細胞的先天性免疫。

2.4 選擇性激活FcγRⅢ后PRRSV對PAM細胞中抗病毒細胞因子轉錄水平的影響 鼠抗豬FcγRⅢIgG處理PAM細胞后接種PRRSV，在培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后收集細胞，利用已經建立實時熒光定量PCR方法檢測不同時間段PAM細胞IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平的變化。如圖4所示FcγRⅢIgG選擇性激活PAM后感染PRRSV，與對照組PRRSV感染PAM細胞組相比，IFN-α mRNA轉錄水平在12～72 h期間顯著下降，是其0.09～0.52倍;TNF-α mRNA轉錄水平在12～72 h期間顯著下降，是其0.02～0.21倍。這些數(shù)據顯示豬FcγRⅢ介導PRRSV感染抑制宿主細胞抗病毒因子轉錄水平。

2.5 選擇性激活豬FcγRⅢ對PRRSV在PAM細胞中增殖的影響 為研究選擇性激活 FcγRⅢ對PRRSV增殖規(guī)律的影響，用純化鼠抗豬 FcγRⅢIgG 處理PAM細胞后接種PRRSV，在感染12、24、36、48、60、72 h后用已建立的Real-time qPCR方法檢測感染不同時間段PAM細胞中PRRSV的拷貝數(shù)。如圖5所示，選擇性激活 FcγRⅢ后 PAM細胞中的PRRSV的拷貝數(shù)與單純接毒的PAM細胞相比在12、24、36、48、60、72 h 顯著升高，高 3.74～ 148.93倍，72 h是最高，達到148.93倍。這些數(shù)據說明選擇性激活FcγRⅢ能夠增強PRRSV在PAM細胞中的復制水平。

圖1PAM細胞中PRRSV拷貝數(shù)Fig.1 Copies of viral replication in porcine PAM cells

圖2 PRRSV感染細胞、LPS處理細胞、健康細胞IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平變化Fig.2 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells or LPS stimulated cells or mock normal cells

圖3 選擇性激活FcγRⅢ誘導PAM細胞IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平變化Fig.3 IFN-α and TNF-α mRNA levels in procine PAM cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

圖4 選擇性激活FcγRⅢ處理PAM細胞后接種PRRSV誘導IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平變化Fig.4 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

圖5 選擇性激活FcγRⅢ后PRRSV拷貝數(shù)Fig.5 Copies of viral replication in porcine PAM cells，pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

3 討論

本試驗主要是用已經建立的實時熒光定量PCR方法檢測不同方法處理的PAM細胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平變化和PRRSV拷貝數(shù)的變化，來探討FcγRⅢ介導PRRSV誘導的免疫抑制反應。FcγRⅢ(CD16)為中等親和力的抗體結合受體，含有2個Ig樣胞外區(qū)結構域，是唯一在NK細胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體。它由兩個不同的基因編碼，它們在不同細胞類型上選擇性表達。在單核細胞、巨噬細胞、NK細胞表面上表達的是一種被稱為FcγRⅢA的跨膜糖蛋白，另一個FcγRⅢ基因編碼表達糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)連接的蛋白質，稱為FcγRⅢB，它只在嗜中性粒細胞上表達。主要是過FcR-γ鏈，以及與其相連的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的相互作用觸發(fā)細胞活化，F(xiàn)cγRⅢ能夠觸發(fā)多種免疫反應，包括清除免疫復合物、吞噬作用、ADCC、釋放炎性介質、增強抗原提呈等作用。

PRRSV感染PAM細胞后，IFN-α mRNA轉錄水平在PRRSV感染PAM細胞12、24 h后與對照細胞相比顯著上調，感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA 轉錄水平下降;TNF-α mRNA轉錄水平在PRRSV感染12、24、36、48、60、72 h 后均高于對照細胞組。有報道顯示，PRRSV通過阻礙 ISGF 3的核轉位阻止Ⅰ型干擾素的活化和信號轉導通路，抑制IFN-α的產生［24］，但是不同的毒株對IFN-α敏感性和誘導IFN-α的能力不同;而有研究顯示PRRSV誘導TNF-α產生遲緩或者下調，我們的研究表明PRRSV感染前期IFN-α mRNA轉錄水平與對照組相比上調1.35～1.46倍，感染后期 IFN-α mRNA轉錄水平下調0.70～0.78倍;而TNF-α mRNA轉錄水平在72 h內上調1.15～2.49倍。原因可能是不同的分離株對IFN-α、TNF-α轉錄水平的影響不同，而實驗過程中所選擇的觀察時間段也會影響實驗結果。本試驗表明，選擇性激活 FcγRⅢ后，IFN-α、TNF-α mRNA 轉錄水平在72 h內與對照細胞相比均顯著下調;同時選擇性激活 FcγRⅢ后接種 PRRSV，72 h內與PRRSV對照組相比 IFN-α、TNF-α mRNA轉錄水平也顯著下調。而我們之前的研究顯示選擇性激活抑制性受體FcγRⅡB在PRRSV感染后能夠顯著提高抗病毒因子的 mRNA 轉錄水平［25］;Thomas等［25］研究顯示巴西利什曼原蟲感染FcγRⅢ缺陷小鼠后，發(fā)現(xiàn)FcγRⅢ缺陷小鼠能夠抵抗巴西利什曼原蟲感染，同時 IFN-γ mRNA轉錄水平顯著上調，而 IL-10 mRNA轉錄水平下調。由此推測選擇性激活 FcγRⅢ能夠抑制宿主細胞的先天性免疫，F(xiàn)cγRⅢ能夠抑制PRRSV感染后的抗病毒免疫反應。有資料顯示巨噬細胞和嗜中性粒細胞的吞噬作用主要由FcγR介導，而缺失 FcγR可致巨噬細胞的吞噬作用喪失［26］。由此我們推測選擇性激活 PAM細胞的FcγRⅢ后，增強PAM細胞吞噬PRRSV的能力，促進病毒進入PAM細胞，加強PRRSV在細胞內復制。本試驗證明，選擇性激活FcγRⅢ后再感染PRRSV，72 h內PRRSV的拷貝數(shù)與病毒對照組相比顯著提高，這可能是由于選擇性激活 FcγRⅢ后，能抑制PAM細胞中抗病毒因子水平，同時促進PAM細胞對PRRSV吞噬作用所致。

實驗結果表明，PRRSV感染PAM細胞后48 h病毒的拷貝數(shù)最高，隨后逐漸下降，PRRSV能夠抑制IFN-α mRNA轉錄水平，誘導增強 TNF-α mRNA轉錄水平;FcγRⅢ能夠抑制 PRRSV感染后的抗病毒免疫反應并增強PRRSV在PAM細胞中的復制。本次研究探討了FcγRⅢ介導PRRSV的免疫抑制反應，為研究FcγR途徑介導PRRSV增強病毒感染的作用機制提供了依據。

［1］屈雪琪，趙建增，梁智選，等.豬繁殖與呼吸綜合征的免疫學研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(8):194-198.

［2］Wootton SK，Yoo D.Homo-oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages［J］.J Virol，2003，77:4546-4557.

［3］Duan X，Nauwynck HJ ，Pensaert MB.Effects of origin and state of differentiation and activation of monocytes/macrophages on their susceptibility to PRRSV［J］.Arch Virol，1997，142:2483-2497.

［4］Duan X，Nauwynck HJ，F(xiàn)avoreel HW，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of alveolar macrophages can be blocked by monoclonal antibodies against cell surface antigens［J］.Adv Exp Med Biol，1998，440:81-88.

［5］Voicu IL，Silim A，Morin M，et al.Interaction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with swine monocytes［J］.Vet Rec，1994，134:422-423.

［6］Kimman TG，Cornelissen LA，Moormanm RJ，et al.Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)vaccinology［J］.Vaccine，2009，8(27):3704-3718.

［7］Chang HC，Peng YT.Phenotypic and functional modulation of bone marrow-derived dendritic cells by porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Vet Microbiol，2008，129:281-293.

［8］Peng YT，Chaung HC，Chang HC，et al.Modulations of phenotype and cytokine expression of porcine bone marrow-derived dendritic cells by porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Vet Microbiol，2009，136:359-365.

［9］Patton JB，Rowland RR，Dongman YOO，et al.Modulation of CD163 receptor expression and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine macrophages［J］.Virus Research，2009，140:161-171.

［10］Albina E，Carrat C，Charley B.Interferon-alpha response to swine arterivirus(PoAV)，the porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Interferon Cytokine Res，1998，18:485-490.

［11］Yoon KJ，Wu LL，Zimmerman JJ，et al.Antibody-dependent enhancement(AD E)of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRR SV)infection in pigs［J］.Viral Immunol，1996，9:51-63.

［12］Yoon KJ，Wu LL，Zimmerman JJ，et al.Field isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)vary in their susceptibility to antibody dependent enhancement(ADE)of Infection ［J］.Vet Microbiol，1997，55:277-287.

［13］Cancel-Tirado SM，Yoon KJ.Antibody-dependent enhancement of virus infection and disease［J］.Viral Immunol，2003，16:69-86.

［14］Mateu E，Diaz I.The challenge of PRRS immunology［J］.Vet J，2008，177:345-351.

［15］Halstead SB，Mahalingam S，Marovich MA，et al.Ntrinsic antibody-dependent enhancement of microbial Infection in macrophages:disease regulation by immune complexes［J］.Lancet Infect Dis，2010，10:712-722.［16］Ravetch JV.In vivo veritas:the surprising roles of Fc receptors in immunity［J］.Nat Immunol，2010，3(11):183-185.

［17］Kacskovics I.Fc receptors in livestock species［J］.Vet Immunol Immunopathol，2004，102(4):351-362.

［18］Flesch BK，Jurgen Neppert.Functions of the Fc receptors for immunoglobulin G［J］.J Clin Lab Anglysis，2000，4(14):141-156.

［19］徐紅運，夏平安，張鳳華，等.豬FcγRⅢ的原核表達及多克隆抗體的制備［J］.中國生物工程雜志，2010，30(6):117-121.

［20］徐紅運，夏平安，王中明，等.豬肺巨噬細胞FcyRⅢ受體基因的克隆與序列分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(4):66-71.

［21］段二珍，周永輝.FcγRIIB介導的PRRSV感染的抗體依賴性增強作用［J］.中國獸醫(yī)學報，2012，8(32):1105-1109.

［22］張宜娜，李 珂.免疫復合物對PRRSV誘導的PAM細胞因子轉錄的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2012，10(43):1589-1597.

［23］Qiao SL，F(xiàn)eng LL，Bao DK.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and bacterial endotoxi act in synergy to amplify the inflammatory response of infected macrophages［J］.Vet Microbiol，2011，149(1-2):213-220.

［24］Deendayal Patel，Yuchen Nan，Meiyan Shen，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus inhibits type I interferon signaling by blocking STAT1/STAT2 nuclear translocation［J］J Virol，2010，84(21):11045-11055.

［25］Thomas BN，Buxbaum LU.FcγⅢ mediates immunoglobulin G-Induced interleukin-10 and is required for chronic leishmania mexicana lesion［J］.Infec Immuinity，2008，2(76):623-631.

［26］Garcia-Garcia E，Rosales C.Signal transduction during Fc receptor-mediated phagocytosis［J］.J Leukoc Biol，2002，72(6):1092-1108.