金澄宇 郭 睿 馬金山 努爾蘭 李先鋒(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，烏魯木齊 830001)

食管癌是原發(fā)于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，尤其是食管鱗狀細(xì)胞癌，發(fā)病率在全世界存在著較大的區(qū)域性、種族性和民族差異性［1］。在我國(guó)的新疆地區(qū)，哈薩克族和維吾爾族的發(fā)病率高居不下，分別名列第一、二位。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染與食管癌的關(guān)系十分密切［2］。Ki67是增殖細(xì)胞核抗原，表達(dá)于除G0、G1早期以外的細(xì)胞周期中，是可靠而全面地反映細(xì)胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶2(Maixmetalloproteinases2，MMP2)是 MMPs家族的一員，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［4］。為探討Hp感染與腫瘤增殖和侵襲惡性程度的關(guān)聯(lián)，本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)新疆維族食管鱗癌組織中Hp感染與Ki67和MMP2的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2010年1月至2013年6月原發(fā)性食管鱗癌手術(shù)切除病理組織石蠟標(biāo)本164例，所有患者術(shù)前未經(jīng)放化療治療。男性118例，女性46例，年齡20～80歲，平均年齡56.6歲，皆為維吾爾族。另選擇我院30例創(chuàng)傷死亡尸檢標(biāo)本的食管組織作為對(duì)照組，該組標(biāo)本均經(jīng)組織學(xué)確認(rèn)為正常組織。其中男性17例，女性13例，年齡 32～78歲，平均年齡54.1歲，皆為維吾爾族。兩組在年齡、性別方面無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并均經(jīng)HE染色后確認(rèn)病理診斷，臨床資料完整。

1.2 試劑和方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人 Hp抗體(Abcam，1∶1 000)、兔抗人 Ki67抗體(Abcam，1∶100)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;鼠抗人MMP-2抗體(Abcam，1∶1 000)購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法二步，Hp陽(yáng)性對(duì)照組織為正常胃組織;Ki67陽(yáng)性對(duì)照組織為正常扁桃體組織，MMP2陽(yáng)性對(duì)照組織為乳腺癌組織。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判定 采用雙盲法觀察陽(yáng)性反應(yīng)。Hp陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性部位呈棕黃色;而Ki67陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性部位呈棕黃色。無(wú)棕黃色表達(dá)者為陰性。MMP2陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(放大倍數(shù)400倍)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分?jǐn)?shù)均值，當(dāng)此均值 ＞10%即為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)用率或者百分?jǐn)?shù)表示，使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，兩變量關(guān)聯(lián)性分析采用卡方檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及對(duì)照組中Hp、Ki67和MMP2抗原檢測(cè)結(jié)果 Hp、Ki67和MMP2在食管癌及對(duì)照組中的表達(dá)情況依次如圖1所示，食管癌中Hp陽(yáng)性率81.7%，對(duì)照組Hp陽(yáng)性率26.7%。食管癌組與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=39.16，P＜0.01)，見(jiàn)表1。食管癌中Ki67陽(yáng)性率67.1%，對(duì)照組Ki67陽(yáng)性率6.67%，食管癌組與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=37.92，P＜0.01)，見(jiàn)表1。食管癌中MMP2陽(yáng)性率86.6%，對(duì)照組MMP2陽(yáng)性率13.4%，食管癌組與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=47.07，P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 食管癌及對(duì)照組中Hp感染與Ki67抗原表達(dá)的相關(guān)性 表2示，食管鱗癌患者中Hp陽(yáng)性表達(dá)組的Ki67抗原的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Hp陰性組。分析表明，食管癌中Hp的檢出率與Ki67抗原陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)(rs=0.340，P＜0.01)，見(jiàn)表2。

2.3 食管癌及對(duì)照組中Hp感染與MMP2抗原表達(dá)的相關(guān)性 表3示，食管鱗癌患者中Hp陽(yáng)性表達(dá)組的MMP2抗原的陽(yáng)性表達(dá)率高于Hp陰性組。分析表明，食管癌中Hp的檢出率與MMP2抗原陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)(rs=0.739，P＜0.01)，見(jiàn)表3。

圖1 食管癌組織與對(duì)照組中Hp、Ki67和MMP2的表達(dá)情況Fig.1 Expression of Hp(A，D)，Ki67(B，E)and MMP2(C，F(xiàn))in tissues of esophageal carcinoma and control group

表1 食管癌及對(duì)照組中Hp、Ki67和MMP2抗原檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of antigen(Hp，Ki67，MMP2)detection for esophageal carcinoma and control group

表2 食管癌Hp表達(dá)與Ki67表達(dá)的關(guān)系Tab.2 Relationship between Hp expression and Ki67 expression in esophageal carcinoma cells

表3 食管癌Hp表達(dá)與MMP2表達(dá)的關(guān)系Tab.3 Relationship between Hp expression and MMP2 expression in esophageal carcinoma cells

3 討論

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將Hp納入第一類致癌原，隨著對(duì)Hp致病性的深入研究，Hp感染在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用已引起人們注意，有關(guān)Hp與食管癌研究的報(bào)道也隨之增加。有研究指出，人群中食管的Hp感染率約為胃的Hp感染率的1/3，而在食管鱗癌中，Hp檢出率很高，且與食管鱗癌癌變的好發(fā)部位是一致的［5］。我國(guó)Hp感染率為40%～60%，但存在很大的地區(qū)差異。本實(shí)驗(yàn)表明，Hp在維族中感染率很高，且與食管癌的發(fā)生有重要的關(guān)系。本結(jié)果與其他認(rèn)為新疆維族Hp感染率明顯低于國(guó)內(nèi)平均水平的研究相反［6］。

Ki67是由分子量為345 kD和395 kD的兩條多肽鏈組成的核蛋白。Ki67在有絲分裂后期迅速降解或失去抗原決定簇，優(yōu)于目前常用的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，被認(rèn)為是可靠而全面地反映細(xì)胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)［7］。在癌前病變階段，長(zhǎng)期持續(xù)的Hp感染可促進(jìn)Ki67的過(guò)度表達(dá)，其中的推測(cè)理由是幽門螺桿菌釋放的脂多糖、尿素酶、空泡毒素與黏附素等重要的毒性致病因子刺激上皮細(xì)胞受體，宿主會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)抑素分泌紊亂、炎性介質(zhì)釋放、氧自由基形成、上皮細(xì)胞增殖與凋亡失衡、癌基因與抑癌基因突變等改變。在本研究中，Ki67在食管癌中明顯表達(dá)，且與Hp感染成相關(guān)性。Ki67在新疆維族中陽(yáng)性率較高，表明新疆食管癌增殖能力較強(qiáng)，破壞性較大，危害性更嚴(yán)重。

MMP2是MMPs家族中重要的一員，是降解基底膜成分Ⅳ型膠原纖維的主要酶。在癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用［8］。在本研究中，MMP2在食管癌中表達(dá)明顯，且與Hp感染成相關(guān)性。MMP2在新疆維族中陽(yáng)性率極高，表明新疆食管癌具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

Hp感染不僅能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖，同時(shí)也可誘導(dǎo)其侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致上皮細(xì)胞增殖和凋亡的異常增加，使細(xì)胞具備了向惡性方向轉(zhuǎn)化的條件。其機(jī)制可能與Hp感染后引起的炎癥反應(yīng)及釋放炎癥介質(zhì)有關(guān)，這些因素一方面引起細(xì)胞損傷致使細(xì)胞增殖加快而增生活躍的細(xì)胞，其DNA合成旺盛，易受基因毒致癌物質(zhì)的損傷，因而易發(fā)生基因的不穩(wěn)而癌變，而增殖過(guò)度若超過(guò)凋亡速度時(shí)，使增殖與凋亡之間失衡，導(dǎo)致了食管癌的形成。另一方面炎癥時(shí)組織內(nèi)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，這些炎性細(xì)胞在炎癥刺激下尚可合成具有高度反應(yīng)活性的氮氧化物，繼而再形成N-亞硝基化合物及硝酸鹽和亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA的損傷和細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞本身持續(xù)性釋放NO也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［9］。本實(shí)驗(yàn)中，食管癌組Hp、Ki67和MMP2表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，與多數(shù)研究結(jié)果一致［8，10，11］。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，Ki67和MMP2的表達(dá)相應(yīng)增高，提示Hp的感染與腫瘤增殖和侵襲惡性程度相關(guān)。

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