易達委 孫 斌 劉曉霓 陳德喜 王延軍
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京市肝病研究所,北京 100069)
肝細胞癌(HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,我國每年約11萬人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。免疫治療因其靶向性好,副作用少而廣受關(guān)注,而鑒定一個有效的分子靶點則是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。在此,我們將討論磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的結(jié)構(gòu)、功能和生物學(xué)特點,并將其作為癌癥免疫療法中藥物作用靶點的潛能為討論重點,研究其在人類癌癥治療中的作用。
GPC3是一種在HCC以及黑色素瘤等多種癌癥中高度表達的膜蛋白,其基因編碼的70 kD核心蛋白被前蛋白轉(zhuǎn)換酶Furin酶切后,產(chǎn)生40 kD的氨基端亞單位和30 kD具有兩條硫酸乙酰肝素(HS)鏈的羧基端亞單位。GPC3蛋白通過糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI)錨定在細胞膜上(如圖1所示)。羧基末端的膜結(jié)合蛋白可以被單克隆抗體(mAb)1G12識別。GPC3與Wnt及Hedgehog(HH)信號蛋白相關(guān)[1]。GPC3可以與Wnt信號分子形成一個復(fù)合體,并通過刺激Wnt信號促進肝癌生長。GPC3的突變將導(dǎo)致GPI錨定域的缺失,阻斷Wnt信號通路,從而抑制依賴于Wnt信號的腫瘤生長。在人HEK-293細胞中制造出缺少 GPI錨定域的重組sGPC3蛋白,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制HCC的生長[2],但不能排除是由于其他因素造成。實驗中也發(fā)現(xiàn),GPC3可通過與HH信號通路的相互作用,調(diào)節(jié)生長發(fā)育[1,3]。此外,GPC3 的 HS 鏈可以與 FGF-2 成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)相互作用,并調(diào)節(jié)生長因子的活性,在肝癌細胞中也發(fā)現(xiàn)了GPC3與FGF-2的相互作用現(xiàn)象[4]。
HCC和CCA是原發(fā)性肝癌的兩種主要形式,越來越多的證據(jù)支持GPC3可作為肝細胞癌的一種新的腫瘤標(biāo)志物。GPC3在肝癌組織中高表達,而膽管細胞癌及正常的肝組織中則不表達。GPC3在HepG2和 Hep3B 細胞,HT17、HuH6、Huh7和 PLC/PRF/5等HCC細胞株中均高度表達。利用單克隆抗體1G12檢測或免疫組織化學(xué)方法檢測[5,6],可以在70%以上的肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)GPC3,其余非肝細胞癌病例均為陰性,包括膽管癌、肝轉(zhuǎn)移癌、肝細胞癌癌旁肝組織(包括肝硬化和血管瘤旁肝組織)。
圖1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of the GPC3 protein.
由于發(fā)現(xiàn)GPC3陽性患者的5年生存率較GPC3陰性患者低(54.5%vs 87.7%,P=0.031),具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,證明GPC3的表達與肝細胞癌的預(yù)后不良情況密切相關(guān)[7]。在肝移植的患者中,血管侵犯與GPC3的表達顯著相關(guān),而沒有GPC3表達的患者無復(fù)發(fā)生存期顯著延長(P<0.05),表明GPC3 mRNA的過度表達可能是肝移植術(shù)后的不良指標(biāo)。
GPC3也在黑色素瘤、卵巢透明細胞癌、卵黃囊瘤(YST)、神經(jīng)母細胞瘤、肝母細胞瘤、腎母細胞瘤細胞、睪丸非精原細胞瘤、脂肪肉瘤以及胃癌的特殊群體GPC3-GC中,也具有較低程度的表達。然而,目前GPC3在除HCC以外的其他人類腫瘤中診斷意義仍不明確。
GPC3在HCC組織中高度表達,且檢測陽性的患者,其血液中也可以檢測到少量的GPC3[5],因而血液中的GPC3含量將可能作為一種有效的診斷依據(jù),并以此監(jiān)測這些患者的病情發(fā)展。Filmus及其同事開發(fā)出了能與GPC3羧基端特異性結(jié)合的單克隆抗體1G12[5]。在泰國最近完成的一項研究中,利用單克隆抗體1G12檢測,發(fā)現(xiàn)有53%HCC患者的血清中呈現(xiàn)明顯的GPC3陽性,但在健康的血清提供者及肝炎患者的血清中則檢測不到[8]。此外,GPC3還是HCC患者根治性切除后,用于預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)和總生存期的一種潛在的、可靠的生物標(biāo)志物,高GPC3的表達是癌癥復(fù)發(fā)的危險信號,而低表達的患者預(yù)后一般較好[9]。
AFP作為肝癌腫瘤標(biāo)志物,受其敏感性和特異性限制,單獨檢測難以區(qū)別不同肝癌。而GPC3在HCC組織中高度表達,且在AFP陰性患者中也有很高檢測率,其mRNA的陽性表達率高達70%[8]。研究顯示,GPC3作為血清標(biāo)志物與AFP聯(lián)合檢測診斷肝癌,可以提高診斷的敏感性[10]。
區(qū)分肝細胞癌與膽管細胞癌,尤其是肝內(nèi)膽管細胞癌(ICC),是一個至關(guān)重要的問題。GPC3在肝細胞癌中高度表達,而在肝內(nèi)膽管細胞癌及膽囊癌中檢測不到[11]。因此,這些研究表明GPC3具有作為原發(fā)性肝癌,尤其是肝細胞癌的診斷潛力[8,12]。如圖2所示,大部分在肝細胞癌中表達的GPC3都表現(xiàn)出細胞質(zhì)分布。相關(guān)研究表明,幾乎一半的HCC病例表現(xiàn)出混合分布(細胞質(zhì)和細胞膜),而另一半僅表現(xiàn)為細胞質(zhì)分布[7]。最近的一項研究利用HepG2的移植組織,完成了對GPC3免疫組化的組織處理方法的優(yōu)化[13]。進一步的研究需要闡明是否不同分布的GPC3具有不同的功能意義和診斷價值。
考慮到在肝癌,黑色素瘤和卵巢透明細胞癌的高度表達,GPC3被認為可作為潛在的靶點用于腫瘤免疫治療。其對于抗GPC3抗體以及細胞基礎(chǔ)的免疫療法的有效性已經(jīng)得到開發(fā)和探索[14]。
3.1 HCC的抗GPC3抗體療法 抗GPC3抗體作為HCC免疫治療的潛能日漸得到重視,許多特異性結(jié)合GPC3的單克隆抗體也相繼被發(fā)現(xiàn),包括1G12、M18D04、M19B11、A1836A 和 GPC3-C02 等。近年發(fā)現(xiàn)的人重鏈可變區(qū)抗體HN3與GPC3有較高親和力,且對GPC3陽性細胞的增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用[15]。另一高親和力的單克隆抗體Yp7在裸鼠體內(nèi)對肝癌移植瘤表現(xiàn)出了明顯的生長抑制作用[16]。這些抗體在GPC3陽性HCC的免疫治療方面表現(xiàn)出顯著潛能。
第一個用于治療的抗GPC3單克隆抗體GC33(IgG2a,κ),其抗原表位位于羧基末端[14,17]。這一抗體在皮下異位移植 HepG2 和HuH-7移植瘤的小鼠中,誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用(ADCC),并展現(xiàn)出抑制腫瘤生長的作用。GC33誘導(dǎo)的ADCC抗腫瘤活性主要是由自然殺傷細胞產(chǎn)生[14]。GC33同樣能夠減少在肝內(nèi)原位移植HepG2細胞的小鼠血液中甲胎蛋白的含量。通過CDR移植法制造出的人源GC33(hGC33)與GC33一樣對HepG2的移植有作用[18]。另一方面,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了GPC3的膜表達與腫瘤相關(guān)性巨噬細胞(TAM)相關(guān)[19,20]。在這些證據(jù)的基礎(chǔ)上,Takai等觀察到在使用GC33的抗GPC3免疫治療模型中,存在TAM侵入,表明巨噬細胞可能在GC33抗體的腫瘤活性中起到重要作用,而抗腫瘤活性可能通過調(diào)節(jié)GPC3功能,而不是ADCC機制發(fā)揮效應(yīng)。此外,GC33不能直接抑制GPC3陽性腫瘤細胞的增殖。曾有人提出,抗GPC3抗體可能會增加肝細胞癌對化療藥物的敏感性。最近hGC33與標(biāo)準(zhǔn)化療劑相結(jié)合的抗腫瘤活性已受重視。在HepG2的移植瘤模型中,hGC33和索拉非尼相結(jié)合時比單獨使用索拉非尼更能有效地抑制腫瘤的生長。這種組合方案可能作為一種肝癌的治療方式,具有很高的臨床應(yīng)用價值。
圖2 GPC3在人原發(fā)性肝癌中的表達Fig.2 GPC3 expression in human primary liver cancer
基于這些結(jié)果,以HCC晚期治療為對象的Ⅰ期臨床試驗已進行評估。該研究表明,患者對GC33耐受性良好,且副作用與劑量相關(guān),每周安全的靜脈給藥量為20 mg左右[22]。目前Ⅱ期臨床試驗正在招募之中:www.clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT01507168。
3.2 GPC3合成肽疫苗 在皮下異位移植腫瘤的小鼠身上,由于轉(zhuǎn)入了鼠GPC3基因的Colon26細胞系,其轉(zhuǎn)錄的GPC3肽段或GPC3特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)可通過樹突狀細胞引起小鼠的保護作用[23]。這項工作表明GPC3在小鼠中具有高度的免疫原性,可以誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng),并不產(chǎn)生自身免疫性疾病。但有數(shù)據(jù)顯示,CD8+T細胞定向性癌癥疫苗在HCC的治療中,療效有限(除非能夠鑒定出應(yīng)答產(chǎn)生的最佳共刺激信號),而CD4+T細胞定向性癌癥疫苗則值得開發(fā)利用[24]。
在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠中,GPC3疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肽反應(yīng)性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL),并且不產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)[25]。此外,接種這些CTL的NOD/SCID小鼠其肝癌移植瘤的生長受到顯著抑制。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上進行了Ⅰ期臨床試驗,發(fā)現(xiàn)接種疫苗的耐受性良好,且在33例中有30例患者產(chǎn)生了可檢測的免疫應(yīng)答反應(yīng),且免疫應(yīng)答的水平與總生存期之間有一定相關(guān)性[26]。目前正在進行Ⅱ期臨床試驗,并計劃將GPC3合成肽疫苗與化療相結(jié)合[26]。
3.3 GPC3功能阻斷 除上述的免疫治療方法外,還有相關(guān)研究試圖通過阻斷GPC3的功能來達到治療目的[27]。最近發(fā)現(xiàn),突變型GPC3由于缺少GPI不能附著于細胞膜,以致被排出到細胞外液而減少膜上的Wnt信號,并減少其與G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合。此外,還發(fā)現(xiàn)異位的突變型GPC3能夠抑制幾種肝癌細胞株在體內(nèi)外的生長。除了抑制Wnt信號之外,在某些細胞株中由于GPC3的外排,導(dǎo)致其通過HS鏈結(jié)合的生長因子也被從細胞膜上清除[27]。另一項研究表明,用重組蛋白處理HCC細胞能夠抑制突變型GPC3的功能和活性[2]。
由于GPC3在肝細胞癌中的高度表達,目前其被認為可作為HCC抗體和細胞療法的靶點。將來工作的方向可能是研制出新一代的GPC3單克隆抗體,這種單抗能夠靶向于包括HS鏈等在內(nèi)的多種功能域,與GPC3相結(jié)合;并在實驗中檢驗抗GPC3單克隆抗體能否通過阻斷Wnt信號和/或其他信號途徑中的配體與受體的相互作用,來直接抑制腫瘤生長。此外,最新的研究表明,血清型GPC3可能具有腫瘤標(biāo)志物價值,能夠在腫瘤診斷和表達GPC3的惡性腫瘤患者的后續(xù)觀察中發(fā)揮作用。然而,血清GPC3的生化性質(zhì)仍然在研究之中。而對于GPC3的三維結(jié)構(gòu)和GPC3從癌細胞脫落的分子機制將很有研究價值。此外,免疫組化的研究表明,GPC3還具有腫瘤診斷的病理學(xué)價值。通過各種高危人群的大量病例,對GPC3本身或GPC3與其他腫瘤蛋白相組合的進一步研究,能夠驗證使用GPC3作為HCC以及其他表達GPC3腫瘤的診斷標(biāo)志物的重要價值。
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