張震中 梁曉鷹 呂光耀 姚 華(新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830054)

腦卒中目前是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的三大疾病之一，腦卒中是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的多基因病，確定腦卒中的易感基因乃至找到關(guān)鍵基因，可以從分子水平對(duì)腦卒中的發(fā)病機(jī)制有進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，由于腦卒中是多基因病，在檢測(cè)多基因病的多個(gè)基因微效效應(yīng)方面，候選基因關(guān)聯(lián)分析主要是選擇與多基因疾病有生物學(xué)聯(lián)系的基因或者與該疾病已知相關(guān)基因具有同源性的基因作為候選基因，研究該候選基因與該疾病的發(fā)病是否具有相關(guān)性。薈萃分析結(jié)果提示脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性與腦卒中之間存在著顯著的關(guān)聯(lián)［1］。一項(xiàng)Meta分析提示脂聯(lián)素水平降低與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)［2］。胡曉波等［3］研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因-3971A/G多態(tài)性的 GG型可能是缺血性卒中發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子。脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是新近發(fā)現(xiàn)的脂肪組織特異性分泌的激素蛋白，研究表明APN在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抵抗作用，是一種保護(hù)性脂肪因子［4，5］。APN 具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用，增加內(nèi)皮源性NO的產(chǎn)生與釋放［6］。APN增加脂肪酸的氧化，降低血TG水平，減少脂質(zhì)沉積，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的裂解，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的增殖及巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，抑制動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的形成［7］。臨床研究表明，缺血性卒中患者血清APN水平較健康對(duì)照組顯著降低［8］。

新疆屬我國(guó)的腦卒中高發(fā)地區(qū)，存在明確的民族及環(huán)境特征，由于動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管最為常見(jiàn)的共同病因基礎(chǔ)，本研究定位于脂質(zhì)代謝相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子Adiponectin，對(duì)新疆維漢民族缺血性腦卒中患者進(jìn)行脂聯(lián)素基因多態(tài)性及其相關(guān)的研究，通過(guò)分子生物學(xué)原理研究其與腦卒中的相關(guān)性及其在維漢民族之間有無(wú)差異。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組

1.1.1 病例組 所有入選的研究對(duì)象均來(lái)源于2011年3月至2013年3月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的住院病人210例，其中漢族121例，平均年齡(58.71±9.32)歲，男67例，女54例;維吾爾族89例，平均年齡(57.44±10.15)歲，男53例，女36例。全部均符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010》［9］的急性腦卒中的診斷。

1.1.2 對(duì)照組 同期在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院體檢人群104例，其中漢族47例，平均年齡(55.21±10.92)歲，男26例，女21例;維吾爾族57例，平均年齡(56.24±11.37)歲，男34例，女23例;所有患者均排除腦血管病、自身免疫性疾病、肝腎功能不全和惡性疾病。

1.2 研究方法 對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的維族、漢族缺血性腦卒中患者和對(duì)照組人群抽取血樣，進(jìn)行DNA提取，統(tǒng)一進(jìn)行基因檢測(cè)工作。實(shí)驗(yàn)步驟:(1)通過(guò)haploview軟件，設(shè)定 Taggle_SNPs，篩選 MAF＞0.5以上的SNPs位點(diǎn)信息并與之前查找的基因進(jìn)行比對(duì)，確定本次研究所需SNPs位點(diǎn)信息。(2)基因DNA提取:所有研究對(duì)象均取外周血采用苯酚氯仿抽提法。見(jiàn)圖1。(3) SNaPshot技術(shù)檢測(cè)Adiponectin基因SNPs。(4)引物設(shè)計(jì)及合成:根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息，使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)、擴(kuò)增、延伸并合成引物。(5)PCR反應(yīng)體系:10 μl PCR 反應(yīng)體系:2.5×Buffer 4.0 μl，上游引物(10 μmol/L)0.2 μl，下游引物(10 μmol/L)0.2 μl，Tag(5 U/μl)0.1 μl，DNA(50～ 100 ng/μl)1.0 μl，ddH2O 4.7 μl。擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s×32 cycles;72℃ 8 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢:取2 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。(6)3730XL測(cè)序儀檢測(cè):①96孔板中每孔加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5、8.5)9 μl，PCR 產(chǎn)物0.8 μl;②95℃變性3 min，上機(jī)檢測(cè);(7)PCR直接測(cè)序:直接測(cè)序是確定突變位點(diǎn)堿基的金標(biāo)準(zhǔn)，由北京閱微基因生物公司完成測(cè)序和測(cè)序峰圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Adiponectin基因3個(gè)位點(diǎn)Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)病例組和對(duì)照組ADP基因SNP位點(diǎn)分型采用了擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)，計(jì)算其Ho、He，結(jié)果顯示病例組和對(duì)照組基因SNP位點(diǎn)基因型頻率分布沒(méi)有偏離Hardy-weinberg平衡(P＞0.05)(表1)，因此我們選取的樣本人群具有代表性適合做遺傳學(xué)分析。

2.2 Adiponectin基因3個(gè)位點(diǎn)SNaPshot方法判定基因類(lèi)型 使用SNaPshot方法進(jìn)行SNP位點(diǎn)測(cè)序，峰值圖見(jiàn)圖2～4。

圖1 電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results

表1 Adiponectin基因Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of Adiponectin gene Hardy-weinberg equilibrium test

2.3 病例組與對(duì)照組Adiponectin基因頻率比較將兩組研究對(duì)象分為病例組和對(duì)照組后，根據(jù)不同基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行比較，從表2中可以看出，rs6444175G/A位點(diǎn)基因頻率分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=13.882，P=0.001)。由于病例組rs6444175G/A基因型GA頻率(44.3%)高于對(duì)照組(23.1%)，因此對(duì)rs6444175G/A位點(diǎn)GA基因型進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，如表3所示，應(yīng)用條件Logistic回歸校正傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，如高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血、吸煙，GA基因型頻率病例組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.269;95%CI:1.001～1.952;P=0.012)，提示rs6444175GA基因型是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，患缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)率增加至1.269倍。

2.4 維、漢族人群病例組和對(duì)照組 Adiponectin基因型頻率比較 維、漢族人群與其對(duì)照組進(jìn)行比較，Adiponectin 3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型類(lèi)型分布，通過(guò)χ2檢驗(yàn)，未見(jiàn)顯著差異。但從表4中可以看出，維吾爾族rs182052基因型CC+CT病例組中占到85.2%，對(duì)照組中占到84.2%;rs6444175基因型GG+GA病例組中占到89.9%，對(duì)照組中占到92.9%;rs1501296基因型GA+AA病例組中占到89.9%，對(duì)照組中占到87.7%;與整組研究對(duì)象相比，維族人群中病例組與對(duì)照組各個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布呈一致性。

圖2 Adiponectin SNPrs182052測(cè)序峰值圖Fig.2 Adiponectin SNPrs182052 sequencing peak figure

圖3 Adiponectin SNP rs6444175測(cè)序峰值圖Fig.3 Adiponectin SNP rs6444175 sequencing peak figure

圖4 Adiponectin SNP rs1501296測(cè)序峰值圖Fig.4 Adiponectin SNP rs1501296 sequencing peak figure

2.5 病例組和對(duì)照組Adiponectin等位基因頻率比較 等位基因水平研究結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組比較，Adiponectin基因rs6444175G/A等位基因A在病例組中攜帶頻率明顯高于對(duì)照組，當(dāng)個(gè)體攜帶A等位基因時(shí)，病例組的相對(duì)患病風(fēng)險(xiǎn)率顯著增加至1.481倍(OR=1.481;95%CI:1.219～1.910;P=0.000)(見(jiàn)表5)。

2.6 維、漢族人群病例組和對(duì)照組 Adiponectin等位基因頻率比較 維、漢族人群中病例組與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，Adiponectin各位點(diǎn)等位基因頻率分布未見(jiàn)明顯差異，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表6)。

表2 病例組與對(duì)照組Adiponectin基因型頻率比較〔n(%)〕Tab.2 Comparison of Adiponectin genotype frequency in cases and controls〔n(%)〕

表3 rs6444175GA基因型條件Logistic回歸校正結(jié)果Tab.3 Results of rs6444175GA genotypes of conditional Logistic regression calibration

表4 維、漢族病例組和對(duì)照組Adiponectin基因型頻率比較［n(%)］Tab.4 Comparison of Adiponectin genotype frequency in Uygur，Han case and control groups［n(%)］

表5 病例組和對(duì)照組Adiponectin等位基因頻率比較Tab.5 Comparison of Adiponedtin allele frequency in case and control group

表6 維、漢族病例組和對(duì)照組Adiponectin等位基因頻率比較Tab.6 Comparison of frequency of Adiponectin allele on Uygur and Han case and control groups

3 討論

現(xiàn)代分子生物遺傳學(xué)證實(shí)多數(shù)疾病都是由特定的基因來(lái)調(diào)控的，本次研究選取與腦卒中相關(guān)糖脂代謝相關(guān)的基因，即脂聯(lián)素基因，通過(guò)分析脂聯(lián)素SNP rs182052、rs6444175、rs1501296位點(diǎn)的相關(guān)性，試圖找尋其與缺血性腦卒中之間的關(guān)系，并篩查其產(chǎn)生的基因型及等位基因與疾病的敏感度，并從維漢民族缺血性腦卒中的基因型特點(diǎn)上探討其基因位點(diǎn)有無(wú)差異。

3.1 維、漢民族脂聯(lián)素基因多態(tài)性與缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系 Adamczak等［10］首次報(bào)道了脂聯(lián)素與原發(fā)性高血壓(EH)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示EH患者脂聯(lián)素水平明顯低于正常對(duì)照組，在所有研究對(duì)象中血清脂聯(lián)素水平與血壓水平呈負(fù)相關(guān)，推論脂聯(lián)素可能與高血壓的臨床進(jìn)程有一定的關(guān)系。研究表明，高血壓患者血漿脂聯(lián)素水平較血壓正常者明顯降低，并與收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈血壓均成負(fù)相關(guān)，脂聯(lián)素是發(fā)生高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。相關(guān)研究提示脂聯(lián)素T45G多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性可能存在種族差異［11］，新疆維吾爾族的T2DM高發(fā)是漢族的2倍，其SNP276多態(tài)性位點(diǎn)與T2DM相關(guān);2型糖尿病患者血漿脂聯(lián)素濃度明顯低于正常人群，血漿脂聯(lián)素水平降低與胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙的病理生理改變具有一定的相關(guān)性，脂聯(lián)素是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)標(biāo)志物［12，13］。何慧婧等［14］研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因SNP 45多態(tài)性與涼山州漢族居民2型糖尿病的關(guān)聯(lián)尚不確定。Bang等［15］對(duì)231例腦梗死患者的研究發(fā)現(xiàn)，代謝異常的患者血清脂聯(lián)素水平較低(P=0.002)，而且卒中類(lèi)型不同血清脂聯(lián)素水平亦不相同。楊秀娟等［16］收集動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者的血標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)276G/T多態(tài)性可能參與中國(guó)湖南漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生，且可能影響血脂水平;Chen等［17］研究證實(shí):APN通過(guò)NF-κB信號(hào)通路起到明顯抗炎效應(yīng)，降低腦缺血再灌注損傷，表明具有神經(jīng)保護(hù)作用，APN是潛在的治療缺血性腦梗死的分子靶點(diǎn)。脂聯(lián)素還可通過(guò)提高肝臟合成高密度脂蛋白而促進(jìn)膽固醇的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，高密度脂蛋白除具有膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，還具有抗氧化和抗炎癥作用。

3.2 維、漢族缺血性腦卒中脂聯(lián)素基因多態(tài)性分析

本次研究納入了維族和漢族人群，使用SNaPshot技術(shù)檢測(cè)脂聯(lián)素基因3個(gè) SNP位點(diǎn):rs182052、rs6444175、rs1501296，研究發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)均呈二態(tài)性分布。其中維族Adiponectin基因SNP rs182052位點(diǎn)，在整組人群中，CT型占絕大比例，TT型為最少;rs6444175位點(diǎn)中以 GA型最多，AA型最少;rs1501296位點(diǎn)，以AA型居多，GG最少，但3個(gè)位點(diǎn)病例組和對(duì)照組均無(wú)明顯差異。其中漢族Adiponectin基因 SNP rs182052位點(diǎn)，在整組人群中，CT型占絕大比例，TT型為最少;rs6444175位點(diǎn)中以GG型最多，AA型最少;rs1501296位點(diǎn)，以GA型居多，GG最少，但3個(gè)位點(diǎn)病例組和對(duì)照組均無(wú)明顯差異。Adiponectin基因SNP rs182052位點(diǎn)等位基因，維、漢族人群均以 C等位基因?yàn)橹?rs6444175位點(diǎn)等位基因，兩組均以G等位基因居多;rs1501296位點(diǎn)等位基因，整組人群均以A等位基因?yàn)橹?，但均未?jiàn)顯著差異。本研究首次報(bào)告了新疆維、漢族缺血性卒中人群ADP基因多態(tài)性，此次的研究工作，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素3個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率均未見(jiàn)明顯差異，原因考慮可能與樣本量較少和對(duì)缺血性卒中的納入標(biāo)準(zhǔn)存在差別有關(guān)，需進(jìn)一步做深入研究。

3.3 病例組與對(duì)照組脂聯(lián)素基因多態(tài)性分析 研究病例組與對(duì)照組兩組對(duì)象發(fā)現(xiàn)rs6444175G/A位點(diǎn)基因頻率分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=13.882，P=0.001)，由于病例組rs6444175G/A基因型GA頻率(44.3%)高于對(duì)照組(23.1%)，因此對(duì)rs6444175G/A位點(diǎn)GA基因型行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，和基因型GG、AA比較，GA基因型頻率病例組明顯高于對(duì)照組，應(yīng)用條件Logistic回歸校正傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.269;95%CI:1.001～1.952;P=0.012)，提示 rs6444175GA基因型是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，患缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)率增加至1.269倍。通過(guò)對(duì)病例組人群脂聯(lián)素的3個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)部分差異:病例組人群中 Adiponectin SNPrs6444175等位基因 A頻率高于對(duì)照組，P=0.000，OR=1.481，可能為缺血性腦卒中的易感基因位點(diǎn)。說(shuō)明缺血性腦卒中患者存在著明顯的基因位點(diǎn)變異。

綜上所述，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中Adiponectin基因rs6444175G/A等位基因A可能是其發(fā)病的易感基因位點(diǎn)，而維漢民族之間，雖然在基因型分布上兩組人群未存在顯著差異，但在基因位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)不同SNP位點(diǎn)基因型，存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩組人群存在一定的民族異質(zhì)性，這種差異可能需要我們?cè)谝院蟮难芯恐羞M(jìn)一步尋找相關(guān)的基因位點(diǎn)進(jìn)行研究，脂聯(lián)素基因位點(diǎn)多態(tài)性差異應(yīng)該是維、漢民族腦卒中發(fā)病的重要危險(xiǎn)相關(guān)因素。本研究對(duì)新疆地區(qū)維吾爾族和漢族在缺血性卒中患者ADP基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，探討了其與缺血卒中的關(guān)系。發(fā)病上可能有不同的遺傳易感因素，但對(duì)ADP基因與缺血卒中的確切關(guān)系以及它是如何與其他致病基因相互作用引發(fā)缺血卒中的，仍有待進(jìn)一步研究。

［1］張 歡，莫興波.脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性與腦卒中和高血壓相關(guān)性的薈萃分析［J］.中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2012，12(3):136-139.

［2］李曉霞，關(guān)紅軍，魯俊華，等.脂聯(lián)素水平與腦卒中關(guān)系Meta分析［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2010，26(1):82-84.

［3］胡曉波，倪培華，季慧峰，等.脂聯(lián)素基因-3971A/G多態(tài)性與腦梗死關(guān)系的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14(5):668-672.

［4］Liu M，Liu F.Transcriptional and post-translational regulation of adiponectin［J］.Biochem J，2010，425(1):41-52.

［5］Ziemke F，Mantzoros CS.Adiponectin in insulin resistance:lessons from translational research［J］.Am J Clin Nutr，2010，91(1):258S-261S.

［6］Deng G，Long Y，Yu YR，et al.Adiponectin directly improves endothelial dysfunction in obese rats through the AMPK-eNOS pathway［J］.Int J Obes，2010，34(1):165-171.

［7］Ohashi K，Parker JL，Ouchi N，et al.Adiponectin promotes macrophage polarization toward an anti-inflammatory phenotype［J］.J Biol Chem，2010，285(9):6153-6160.

［8］Sasaki M，Otani T，Kawakami M，et al.Elevation of plasma Retinolbinding protein 4 and reduction of plasma adiponectin in subjects with cerebral infarction［J］.Metabolism，2010，59(4):527-532.

［9］中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫(xiě)組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南［J］.中華神經(jīng)科雜志，2010，43(2):146-153.

［10］Adamczak M，Wiecek A，F(xiàn)unahashi T，et al.Decreased plasma adiponectin concentrations in patients with essential hypertension［J］.Am J Hypertens，2003，16(1):72-75.

［11］康 莊，孫朝昆，趙惠珠，等.大理白族、漢族2型糖尿病與脂聯(lián)素基因多態(tài)性的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)糖尿病雜志，2008，16(12):718-720.

［12］Sattar N.Biomarkers for diabetes prediction，pathogenesis or pharmacotherapy guidance Past，present and future possibilities［J］.Diabet Med，2012，29(1):5-13.

［13］Kishida K，F(xiàn)unahashi T，Shimomura I.Molecular mechanisms of diabetes and atherosclerosis:role of adiponectin［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2012，12(2):118-131.

［14］何慧婧，衛(wèi)大英，王淳秀，等.四川涼山漢族2型糖尿病與脂聯(lián)素基因多態(tài)性［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2012，28(3):302-304.

［15］Bang OY，Saver J L，Ovbiagele B，et al.Adiponectin levels in patients with intracranial atherosclerosis［J］.Neurology，2007，68(22):1931-1937.

［16］楊秀娟，許宏偉，袁 寧，等.湖南漢族人群脂聯(lián)素基因多態(tài)性分布及其與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死和相關(guān)危險(xiǎn)因素的關(guān)系［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2008，16(11):905-909.

［17］Chen B，LiaoW Q，Xu N，et al.Adiponectin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through anti-inflammatory action［J］.Brain Res，2009，1273(1):129-137.