黃 莉 余志武 潘玉先 丘立文 郝 衛(wèi) 丁細(xì)霞 車小燕 余 楠

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣州 510282)

前期研究證實SARS-CoV的核衣殼蛋白(N)可誘導(dǎo)產(chǎn)生強烈的體液和細(xì)胞免疫，是主要的抗原分子［3，4］，也是 SARS-CoV 臨床診斷的最佳靶標(biāo)和預(yù)防疫苗的候選蛋白［3，5］。本實驗室前期工作采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了帶GST標(biāo)簽的重組SARS-CoV的N蛋白(SARS-NP)，并建立了N抗原捕獲抗體夾心ELISA方法用于SARS-CoV 感染的早期診斷［6，7］。為進一步比較研究SARS-CoV、MERS-CoV以及可能出現(xiàn)的新型人冠狀病毒的N蛋白抗原性及其相關(guān)功能，我們擬采用能表達更接近于高等真核生物天然性狀蛋白的桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)，表達重組SARS-CoV核衣殼蛋白(N)。桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)具有與哺乳動物相似的復(fù)雜的翻譯后修飾功能，較原核生物表達系統(tǒng)更適合于表達蛋白的生物活性和免疫原性。

本文在桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)表達了重組SARSNP，并采用原核系統(tǒng)表達的重組SARS-NP兔免疫血清、單抗和SARS患者血清驗證其抗原反應(yīng)性，并初步研究了其與人冠狀病毒229E型(hCoV-229E)和OC43型(hCoV-OC43)的單抗和患者血清的交叉反應(yīng)性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 模板、細(xì)胞和質(zhì)粒及主要試劑 攜帶SARSCoV N基因全長序列的質(zhì)粒pGEX-5X-3/N由香港大學(xué)微生物系提供;pFastBac HTC載體、DH10Bac細(xì)胞、Sf9細(xì)胞和 High Five細(xì)胞、Sf-900Ⅱ SFM、Express Five SFM、Grace's Insect Medium、Cellfectin II Reagent均為美國 Invitrogen公司產(chǎn)品;QIAquick PCR Purification Kit、Min Elute Gel Extraction Kit、QIAprep Spin Miniprep Kit、His-融合蛋白純化試劑盒購自德國QIAGEN公司;Thermo Scientific Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate試劑盒(ECL)為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 血清標(biāo)本 SARS恢復(fù)期血清為2004年收集的SARS確診患者的血清;hCoV-229E和hCoVOC43的血清為經(jīng)實時定量PCR測定呼吸道標(biāo)本為229E和OC43感染的患者的恢復(fù)期血清。健康人血清為各項體檢指標(biāo)正常的健康人血清。

1.3 目的基因擴增 SARS-CoV N基因全長序列引物為上游:5'-cgggatccggATGTCTGATAATGGAC-3'(26 bp)，下游 5'-gcgtcgacTTATGCCTGAGTTGAATC-3'(26 bp);目的片段長度1 269 bp。由上海生工生物技術(shù)公司合成。以pGEX-5X-3/N為模板，含BamHⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點引物序列擴增SARS-NP全長基因。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min，22個循環(huán)(94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min)，72℃ 延伸 7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物。

1.4 pFastBac HTC-SARS載體和桿粒DNA構(gòu)建擴增產(chǎn)物純化后連接pMD19-T載體，經(jīng)篩選、PCR擴增鑒定和基因測序，挑取測序正確陽性克隆，BamHⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切、切膠純化回收，定向插入pFastBacHTC載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞;陽性克隆經(jīng)PCR擴增、酶切鑒定、基因測序，獲得重組質(zhì)粒 pFastBac HTC-SARS-NP，將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選，雙重PCR擴增鑒定，獲得重組桿粒DNA。

1.5 SARS-NP桿狀病毒液擴增及SARS-NP的表達和純化 按操作說明，Sf9細(xì)胞2 ml(8×105cells/孔)加至6孔板，加入210 μl/孔 DNA和 CellfectinⅡReagent混合，27℃培養(yǎng)至顯微鏡可見病變，收取病毒液，取上清感染Sf9細(xì)胞擴增。

取3.5×107pfu/ml上述桿狀病毒液感染2×106cells/ml High Five細(xì)胞，MOI為5，27℃孵育72 h表達SARS-NP，PBS清洗細(xì)胞，裂解緩沖液重懸，凍融一次后取上清，加入0.1%PMSF，經(jīng)His-融合蛋白純化試劑盒純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

在作品中，男女的“犧牲”不同。時雄拋棄了身份、社會地位和邏輯的束縛，舍棄對芳子的愛或貪心。然后，田中也為了自己的東京的前途的光明而舍棄了芳子。另一方面，芳子為了田中的前途，犧牲了自己的夢想和未來。這兩種類型的“犧牲”有什么理由呢？

1.6 雙抗體夾心ELISA方法鑒定SARS-NP 采用本實驗室建立的雙抗體夾心的ELISA方法鑒定重組的SARS-NP，具體步驟詳見文獻［7］。該方法針對SARS-NP的特異性高達99.86%［7］。

1.7 免疫印跡 純化蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)印至 PVDF膜，7%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別與前期制備的抗SARS-NP單抗(8A1E17)(1∶500稀釋)、抗hCoV-229E和抗 hCoV-OC43的雜交瘤上清(1∶200 稀釋)、SARS-CoV、hCoV-229E、hCoV-OC43兔免疫血清(1∶100稀釋)、SARS患者血清和 hCoV-229E、hCoV-OC43患者血清(1∶100稀釋)室溫孵育1 h，洗膜，相應(yīng)的HRP標(biāo)記羊抗鼠/兔/人IgG(1∶1 000稀釋)避光室溫孵育30 min，ECL 顯色［6，8，9］。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pFastBac HTC-SARS-NP的構(gòu)建和鑒定 PCR擴增獲得SARS-NP基因，全長1 269 bp(如圖1)，經(jīng)測序比對，與GeneBank公布的SARS-NP基因序列一致。BamHⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒pFastBacHTC-SARS-NP目的基因正確插入目標(biāo)位點(圖1);測序證實重組質(zhì)粒序列正確。

2.2 SARS-NP重組的桿粒DNA鑒定 SARS-NP重組桿粒DNA經(jīng)兩次PCR鑒定。第一次為針對目的片段特異性引物擴增，結(jié)果與理論預(yù)期1 269 bp一致(圖2A);第二次為M13上游通用引物和下游目的片段特異引物擴增，結(jié)果與理論3 019 bp一致(圖2 B);PCR陰性對照均為陰性(結(jié)果未顯示)。

2.3 SARS-NP的表達和純化 經(jīng)細(xì)胞數(shù)(1×106～3×106cells/ml)、MOI(1、2、5)和表達時間(24、48、72 h)優(yōu)化，細(xì)胞數(shù)2×106cells/ml，MOI為 5，表達72 h，可獲得表達量為0.2 mg/ml、相對分子量為48 kD可溶性蛋白(圖3)。經(jīng)Ni-NTA親和樹脂純化，SARSNP重組蛋白出現(xiàn)相對分子量約35 kD的蛋白條帶，推測為降解物(圖3)。

2.4 SARS-NP抗原性分析

2.4.1 雙抗體夾心ELISA方法鑒定SARS-NP融合蛋白 雙抗體夾心ELISA方法鑒定桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的SARS-NP融合蛋白，結(jié)果顯示，陰性對照(未感染的 Sf9細(xì)胞溶液)OD450值0.070，SARSNP的OD450值/陰性對照OD450值≥2。

2.4.2 免疫印跡印證SARS-NP的免疫抗原性 抗SARS-NP單抗(8E1A17)、原核表達的SARS-NP兔免疫血清、13份SARS患者血清與桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的SARS-NP反應(yīng)。結(jié)果SARS-NP單抗在48、35 kD位置出現(xiàn)條帶(圖4A)，提示SARS-NP有抗原反應(yīng)性，同時可能存在一定程度降解;原核表達的SARS-NP兔免疫血清與桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的SARS-NP在48 kD處可見條帶;8份SARS患者血清可見明顯顯色條帶，5份SARS患者血清見較弱帶;6份正常人血清則未見條帶(圖4B和C)。

圖1 重組質(zhì)粒pFastBac HTC-SARS-NP的雙酶切鑒定圖Fig.1 Endonuclease identification of recombinant plasmid pFastBac HTC-SARS-NP

2.4.3 免疫印跡驗證SARS-NP與其他冠狀病毒(hCoV-229E、hCoV-OC43)之間的抗原相關(guān)性 抗hCoV-229E和抗hCoV-OC43的雜交瘤培養(yǎng)上清、hCoV-229E和hCoV-OC43的兔免疫血清以及相應(yīng)患者血清各5份與桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的SARSNP反應(yīng)。結(jié)果無條帶出現(xiàn)，說明桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的SARS-NP與hCoV-229E和hCoV-OC43免疫血清無交叉反應(yīng)(圖4C)。

圖2 SARS-NP桿粒DNA的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of SARS-NP recombinant Bacmid DNA

圖3 SDS-PAGE分析SARS-NP的表達與純化Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified SARS-NP

圖4 免疫印跡分析SARS-NP的免疫原性Fig.4 Western blot analysis of antigenicity of SARS-NP

3 討論

2002年，廣東省最先報道了 SARS，隨后30多個國家共報道了8 000多例SARS感染病例，死亡率高達5%～10%［4，10］。為早期診斷SARS-CoV 感染，國內(nèi)外研究者以SARS-CoV的主要抗原分子核衣殼蛋白作為靶標(biāo)。有研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得重組N蛋白，并建立了ELISA方法以及病毒裂解液和重組蛋白結(jié)合的免疫印跡方法［11-13］。

原核表達系統(tǒng)操作簡單、價格低廉、周期短，是迄今研究最為成熟、使用最為廣泛的表達系統(tǒng)，本實驗室前期工作也采用原核系統(tǒng)表達出SARS-NP，但原核表達系統(tǒng)不能產(chǎn)生糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化等翻譯后修飾，重組蛋白的生物活性、功能、結(jié)構(gòu)與天然蛋白差別較大［14］。而桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)具有與哺乳動物相似的復(fù)雜翻譯后修飾功能，如蛋白質(zhì)的正確折疊與切割、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、酰化等［15，16］，一定程度上彌補了原核表達系統(tǒng)的缺陷。

本研究通過PCR擴增獲得SARS-CoV NP全長基因，經(jīng)兩個限制性內(nèi)切酶酶切，定向插入pFastBac HTC載體，成功構(gòu)建了pFastBac HTC-SARS-NP重組質(zhì)粒，在High Five細(xì)胞表達，獲得了重組SARS-NP。免疫印跡實驗顯示其能與原核表達的SARS-NP的單抗、兔免疫血清以及SARS患者血清反應(yīng)，而與健康人血清、本地區(qū)其他常見冠狀病毒(hCoV-229E、hCoV-OC43)免疫血清沒有交叉反應(yīng)，說明桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)的重組SARS-NP具有抗原反應(yīng)性，與hCoV-229E、hCoV-OC43抗血清無交叉反應(yīng)。

SARS-NP理論等電點為10.1，具有高親水性，無半胱氨酸殘基和二硫鍵，因而穩(wěn)定性較其他結(jié)構(gòu)蛋白差［17］;在桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)表達外源蛋白過程中，病毒本身會表達半胱氨酸蛋白酶等蛋白酶;High Five細(xì)胞應(yīng)激也會分泌蛋白酶［18-20］;這些因素均可導(dǎo)致蛋白在表達過程中降解，這可能是本研究中獲得一部分相對分子量為35 kD蛋白的原因。雖然優(yōu)化了實驗條件，但降解仍未能徹底消除(未附結(jié)果)。重組蛋白的降解可能可從幾個方面解決:(1)構(gòu)建蛋白酶基因缺失載體;(2)控制表達時間;(3)添加蛋白酶抑制劑［20］。在免疫印跡實驗中，重組蛋白與兔免疫血清的結(jié)合較差，血清效價存在一定程度的損失;可能是由于兔免疫血清為原核來源的重組蛋白免疫所得，保存年份較久遠(yuǎn)(2003年制備)。

綜上所述，本研究在桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)中獲得重組的 SARS-NP，驗證了抗原性，初步研究其與hCoV-229E、hCoV-OC43的交叉反應(yīng)性，為下一步SARS-NP的功能和診斷方法的建立，以及進一步比較MERS-CoV和其他新型冠狀病毒N蛋白的抗原性和相關(guān)功能研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

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