向延芳，傅玉才，許錦階，栗麗，羅麗莉＊

（1.解放軍第169醫(yī)院婦產(chǎn)科，衡陽 421002；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)室，汕頭 515041；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，汕頭 515041）

始基卵泡自胚胎形成后即進(jìn)入自主發(fā)育和閉鎖的軌道，當(dāng)功能性卵泡完全喪失后，卵巢衰老萎縮進(jìn)入絕經(jīng)期［1］。卵泡從卵巢中持續(xù)丟失，就好像時(shí)鐘的指針在不斷前進(jìn)，所以國(guó)外有學(xué)者將這一現(xiàn)象稱為“女性的生物鐘”［2］。始基卵泡的儲(chǔ)備量與生俱來，如果能延緩卵泡成熟的速度，減少卵泡的凋亡將可能延長(zhǎng)女性的生育年限［3］。能量限制（CR）是一種目前公認(rèn)的有效延緩衰老的方法，不僅能延緩衰老，還能延緩和預(yù)防一些與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展［4－5］。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)成年期大鼠限制其能量攝入，觀察CR后長(zhǎng)壽因子SIRT1在卵巢中的定位、表達(dá)，探討其對(duì)大鼠卵巢功能和生殖壽命的影響及可能機(jī)制，為抗卵巢衰老研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)健康8周齡雌性Sprague－Dawley（SD）大鼠24只，初始體重（200±10）g。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物房室溫保持在22℃左右，保持12h自動(dòng)照明。

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為：對(duì)照組（NC），自由飲水，自由取食；CR組，予NC組食量的65%。標(biāo)準(zhǔn)鼠糧持續(xù)喂養(yǎng)8周，飼料（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB14924.3－2001，含蛋白質(zhì)20.11%、脂肪4.84%、粗纖維7.34%）總能量為17.3282MJ／kg。

二、儀器和試劑

儀器：BX－51TRF型生物顯微鏡（Olympus，日本），普通光學(xué)顯微鏡（云南光學(xué)儀器廠），動(dòng)物飼養(yǎng)層流柜（廣州醫(yī)療器械廠）。

試劑：蘇木精（上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠），伊紅（上海試劑三廠），戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司），兔抗鼠SIRT1、β－actin多克隆抗體（Santa Cruz，美國(guó)），生物素連接的抗兔IgG抗體（Jackson，美國(guó)）；ABC（avidin－biotin complex）試劑盒（Vector Laboratories，美國(guó)）。

三、研究方法

1.卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡分類計(jì)數(shù)：每個(gè)卵巢取7張組織切片，切片間隔至少為50μm進(jìn)行H－E染色。計(jì)數(shù)每張卵巢組織切片上所有的各級(jí)卵泡數(shù)（原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡）。

2.免疫組織化學(xué)法（ABC法）檢測(cè)SIRT1在卵巢組織中的定位和表達(dá)：組織切片脫蠟、水化后，3%H2O2作用10min，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次時(shí)間為5min。2%的小牛血清白蛋白封閉30min后滴加兔抗鼠SIRT1抗體（一抗），4℃濕盒中孵育過夜；PBS緩沖液洗滌后滴加二抗，室溫孵育1h；與ABC試劑反應(yīng)30min；DAB顯色后蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。PBS替代一抗作為空白對(duì)照。Olympus BX－51型顯微鏡（日本）下觀察并拍照。陽性結(jié)果判斷：細(xì)胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。應(yīng)用SimplePCI軟件進(jìn)行分析計(jì)數(shù)，灰度值≤55為強(qiáng)陽性，反之為弱陽性。

3.Western blot檢測(cè)SIRT1蛋白在卵巢中的表達(dá)：取新鮮的卵巢放入組織勻漿器中，冰上勻漿提取組織總蛋白，測(cè)蛋白濃度；各實(shí)驗(yàn)組均上樣30μg蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別加入稀釋的β－actin或SIRT1抗體約1ml于室溫下?lián)u床孵育2h；棄一抗，洗滌后加二抗室溫下?lián)u床孵育1h，加入ABC反應(yīng)試劑，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室下X光片成像。GIS凝膠成像系統(tǒng)（上海 Tanon GIS－2009）分析其灰度值。

四、觀察指標(biāo)

能量攝入：每天稱取飼料，計(jì)算攝取熱量；大鼠體重：每周稱取體重記錄；腹部脂肪重量：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分離腎周組織和腹膜后脂肪稱重；卵巢組織形態(tài)學(xué)及卵泡分類計(jì)數(shù)；STRT1蛋白在卵巢中的定位和表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組大鼠每周平均體重比較

圖1 兩組大鼠體重變化情況

與對(duì)照組大鼠比較，CR組的大鼠表現(xiàn)為體重不增或略降，10d左右逐步好轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)開始后，NC組大鼠體重逐漸增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重為（235.24±2.88）g，與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體重［（195.97±3.09）g］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；CR組的體重也是從實(shí)驗(yàn)開始的（200.41±3.02）g逐漸增加到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的（220.77±2.34）g（P＜0.001）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CR組的大鼠體重與NC組相比有顯著性差異（P＜0.05）（圖1）。

二、兩組大鼠腹部脂肪比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CR組大鼠的腹部脂肪量為（3.86±0.22）g，明顯少于 NC組大鼠［（5.51±0.18）g］（P＜0.01）。

三、兩組大鼠卵巢的卵泡數(shù)變化

CR組和 NC組的初級(jí)卵泡［（25.2±1.4）vs.（21.9±0.9）］、次級(jí)卵泡［（18.0±0.8）vs.（20.5±1.4）］和閉鎖卵泡數(shù)［（25.2±1.1）vs.（27.8±1.2）］均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但是CR組與NC組相比，原始卵泡數(shù)顯著增多［（91.5±2.6）vs.（62.3±2.6）］，竇狀卵泡數(shù)顯著減少［（15.2±0.6）vs.（23.0±1.8）］（P＜0.01）。

四、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SIRT1在卵巢組織中的卵母細(xì)胞和間質(zhì)組織中均有表達(dá)，棕色或棕黃色顆?？梢娪诩?xì)胞漿和細(xì)胞核中。NC組卵巢中卵母細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，部分強(qiáng)陽性，胞漿弱陽性，周邊間質(zhì)組織部分弱陽性；能量CR組中卵母細(xì)胞核強(qiáng)陽性表達(dá)，胞漿陽性表達(dá)，周邊間質(zhì)組織陽性表達(dá)（如箭頭所指）（圖2）。

圖2 SIRT1蛋白在卵巢中的表達(dá)與定位（免疫組化ABC法，×200）

五、CR對(duì)大鼠卵巢組織中SIRT1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)顯示，CR組大鼠卵巢組織中的SIRT1高表達(dá)，灰度值掃描值與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 免疫印跡法檢測(cè)卵巢中SIRT1的表達(dá)

討 論

1935年，McCay等［6］首次報(bào)道了CR能顯著提高大鼠的平均壽命和最長(zhǎng)壽命，后續(xù)對(duì)酵母、蠕蟲、果蠅以及哺乳動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)陸續(xù)證明，在滿足機(jī)體對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)素需要量的前提下，適當(dāng)限制能量攝入，能明顯延緩衰老的速度。過去的幾十年中，美國(guó)威斯康星州國(guó)立靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心（WNPRC）和國(guó)立衛(wèi)生院（NIH）動(dòng)物研究中心一直對(duì)延長(zhǎng)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的壽命進(jìn)行CR的相關(guān)研究［7－8］，根據(jù)其研究結(jié)果，30%左右的CR以及18%的體重下降對(duì)于壽命的延長(zhǎng)及健康的改善最為有效，因此本研究選用35%作為能量限制作為研究標(biāo)準(zhǔn)。

CR可減少與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)生率在靈長(zhǎng)類、人類實(shí)驗(yàn)中已有了初步的結(jié)果［9－11］。CR是唯一被科學(xué)界普遍公認(rèn)的除遺傳操作以外延緩衰老的調(diào)控手段，可促進(jìn)脂肪動(dòng)員，預(yù)防脂類代謝紊亂造成的許多疾病，最終延長(zhǎng)壽命。了解CR引起這些效應(yīng)的作用機(jī)制有助于指導(dǎo)人類的飲食和生活方式，起到延緩衰老、預(yù)防疾病發(fā)生的作用。

本研究中NC組大鼠體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)增加，35%CR組大鼠在經(jīng)歷1周左右的體重不增后緩慢增長(zhǎng)。CR組大鼠無營(yíng)養(yǎng)不良表現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體重相比增加明顯，但實(shí)驗(yàn)結(jié)束CR組的大鼠體重顯著低于NC組，CR組腹周脂肪量明顯小于NC組，說明減少過度的能量攝入使大鼠的體重減輕、體內(nèi)脂肪量減少。同時(shí)CR組的原始卵泡數(shù)比NC組明顯增多，竇狀卵泡數(shù)減少，與Selesniemi等［12］的研究結(jié)果一致。由于卵巢的總卵泡數(shù)在胚胎時(shí)期就已經(jīng)是確定的，不能再生［13］，原始卵泡的數(shù)目是女性的基本生殖單位也是卵巢儲(chǔ)備的唯一形式［14］。當(dāng)原始卵泡向著不同級(jí)卵泡成熟轉(zhuǎn)化時(shí)，原始卵泡不斷減少并最終耗竭殆盡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CR可以阻止原始卵泡向成熟卵泡的轉(zhuǎn)化，減少原始卵泡的消耗，保留卵巢的儲(chǔ)備從而延長(zhǎng)生殖壽命。

Sir2（silence information regulator 2）基因家族是一種保守的從古細(xì)菌到哺乳動(dòng)物都存在的NAD＋（煙酰腺嘌呤二核苷酸）依賴的組蛋白／非組蛋白去乙?；福瑢?duì)細(xì)胞的分化、代謝、衰老等生理活動(dòng)都起著十分重要的調(diào)節(jié)作用［15］，是調(diào)節(jié)生物體衰老進(jìn)程的一個(gè)重要基因，其不僅能從遺傳角度影響壽命，還能從CR的代謝角度調(diào)節(jié)細(xì)胞壽命，被認(rèn)為是CR介導(dǎo)發(fā)揮效應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［16－17］。研究發(fā)現(xiàn)，CR能夠引起Sir2的表達(dá)上調(diào)，并且這一現(xiàn)象從低等生物酵母到高等生物如哺乳類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等都普遍存在［18］，哺乳動(dòng)物共有7個(gè)Sir2同源基因（SIRT1～SIRT7），其中SIRT1與Sir2的同源性最高［19］。

由于人類壽命明顯延長(zhǎng)和婚育年齡的推遲，探索如何延長(zhǎng)生殖壽命，延緩生殖系統(tǒng)衰老顯得至關(guān)重要。我們實(shí)驗(yàn)研究中CR大鼠卵巢的SIRT1表達(dá)增強(qiáng)，卵巢的儲(chǔ)備增加，提示SIRT1對(duì)于延緩卵巢衰老延長(zhǎng)生殖壽命有積極的作用。在關(guān)于各種細(xì)胞功能的研究中，SIRT1對(duì)心臟［20］、胰腺［21］、腦血管［22］等均有保護(hù)作用，因此，SIRT1作為治療不同疾病的靶點(diǎn)越來越被重視。隨著研究的深入，它與疾病的相關(guān)性將給我們提供新的臨床思路，SIRT1有可能作為特定作用靶點(diǎn)具有治療潛能。

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