文 靜，程 俊，楊 艷

在血管張力調(diào)節(jié)靶點大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance Ca2+-activated K+channels，BKCa）的研究中，我們用常規(guī)全細胞膜片鉗記錄BKCa和由其開放所介導(dǎo)產(chǎn)生的自發(fā)性瞬時外向電流（spontaneous transient outward currents，STOCs）時，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，BKCa宏觀電流的幅度越來越小且STOCs 很難記錄到，或在很短時間內(nèi)STOCs就完全自行消失，這可能是電極液和細胞內(nèi)液相互滲透，造成胞質(zhì)內(nèi)容物被稀釋，特別是維持離子通道功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)被吸到電極內(nèi)，改變了細胞內(nèi)鈣緩沖能力［1-2］。這極大地局限了我們對細胞內(nèi)局部自發(fā)性的Ca2+釋放事件的深入研究，因此尋求適用于大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞的穿孔膜片鉗方法，以記錄BKCa宏觀電流以及STOCs，為胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供一種更為準(zhǔn)確和穩(wěn)定的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料 正常大鼠,雌雄不拘,體重250～300g,由瀘州醫(yī)學(xué)院動物房提供。木瓜蛋白酶、XI型膠原酶、二硫蘇糖醇（DTT）、兩性霉素B、K-aspartate 和HEPES均購自美國Sigma公司；余為國產(chǎn)分析純試劑。主要實驗儀器：體視顯微鏡（S8APO,LEICA,Germany）；微管電極拉制儀（PC-10,Narishige,Japan）；膜片鉗放大器（Axopatch 200B,Axon Instruments,USA）；A/D-D/A 轉(zhuǎn) 換 器（Digidata-1440A,Axon Instruments,USA）；倒置相差顯微鏡（Axiovert135，Zeiss，Germany）。

1.2 實驗溶液的配制 溶液Ⅰ（mmol/L）（即臺式液）：NaCl 127，KCl 5.9，CaCl22.4，MgCl21.2，HEPES 10，glucose 12；用3 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.40。溶液Ⅱ（mmol/L）為無鈣臺式液。全細胞浴液（mmol/L）：NaCl 134，CaCl2 1.8，MgCl2 1，KCl 6，HEPES 10，glucose 10；pH 用3 mol/L NaOH 調(diào)至7.40。全細胞電極液（mmol/L）：K-aspartate 110，KCl 30，EGTA 0.05，NaCl 10，MgCl2 1，HEPES 10；pH 用KOH 調(diào) 至7.20。酶液：酶Ⅰ（mg/ml）：木瓜蛋白酶0.45，DTT 0.325；酶Ⅱ（mg/ml）：XI型膠原酶0.75。

1.3 急性酶分離大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞 將大鼠麻醉，連同腸段一起快速取出腸系膜，固定在膠盤里，加入4℃的溶液Ⅰ，在體式顯微鏡下分辨動靜脈，仔細剔除血管壁上的纖維結(jié)締組織和脂肪組織，得到分離好的血管組織。將動脈血管放入含有酶液Ⅰ的玻璃小瓶中，在37℃恒溫水浴箱中振蕩25～30min后，快速轉(zhuǎn)入酶Ⅱ中，37℃恒溫水浴箱中振蕩10～12min，取出組織，放人溶液Ⅱ中，輕輕吹打，得到單個腸系膜動脈平滑肌細胞，置于4℃冰箱備用。

1.4 全細胞穿孔膜片鉗記錄及電流記錄方案 室溫25℃，在倒置相差顯微鏡下找到表面光滑且折光性強的細胞，使玻璃微電極靠近該細胞并使電極尖端貼附在細胞表面。負壓抽吸形成高阻封接（阻抗高達1GΩ以上）時，即形成細胞貼附式膜片（cell-attached patch），此后，靜待兩性霉素B 在細胞膜上造成孔道。在穿孔膜片形成的過程中，膜電容逐漸增大，電極的串聯(lián)電阻逐漸減小，約15～20min后，兩者變化趨于穩(wěn)定，表明穿孔膜片已完全形成，接下來按電流方案記錄電流。

全細胞BKCa 宏觀電流記錄采用斜坡刺激方案（保持電位在-60mV，從-80 到+60mV，斜率0.375V/s，時程400 ms）和階躍方波脈沖方案（保持電位在-60 mV，從-60 mV 以10 mV 階躍除極至+60 mV，時程400 ms），刺激頻率1 Hz。STOCs 的記錄方案采用在某一固定電位進行鉗制記錄，時程30s。

2 結(jié)果

2.1 運用全細胞穿孔膜片鉗記錄大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa本實驗采用兩性霉素B 全細胞穿孔膜片鉗技術(shù)記錄大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa宏觀電流。按方波脈沖方案刺激時，當(dāng)一般去極到大于-20～-10 mV左右時，有外向電流的出現(xiàn)，而且電流隨著膜電位的增大而增大，具有一定的外向整流特性。當(dāng)在較高去極電壓時，可以觀察到BKCa宏觀電流上有STOCs 隨機地疊加，呈大噪聲樣（圖1A）。利用斜坡刺激脈沖方案引出的BKCa，為外向電流，其上疊加有STOCs（圖1B）。在觀察的3h 內(nèi)，記錄的電流無隨時間變化而減小的現(xiàn)象。

2.2 運用全細胞穿孔膜片鉗記錄大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞的STOCs 在兩性霉素B 全細胞穿孔膜片鉗下，給予大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞不同的鉗制電壓，時間持續(xù)30s，觀察到隨著細胞膜去極化程度的增大（-30～0 mV），STOCs 的電流幅度和頻率均逐漸增加，呈明顯的電壓依賴性（圖2）。仔細觀察放大的STOCs，其呈不對稱的鐘型，單或雙尖峰樣（圖3），STOCs的出現(xiàn)具有隨機性，且峰值幅度與頻率均具有較大的變異性［3］。在觀察的3h 內(nèi)，記錄的STOCs 無電流幅度及頻率的變化。

圖1 A.全細胞穿孔膜片鉗記錄的大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa宏觀電流，箭頭所指為疊加的STOCs B.用斜坡刺激脈沖方案引出的BKCa，箭頭所指為疊加的STOCs

圖2 -30～0 mV的鉗制電壓下，大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞上的STOCs

圖3 以-10 mV下記錄的大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞上的STOCs為例，箭頭所指為放大的STOCs，呈單或雙尖峰樣

3 討論

平滑肌細胞胞內(nèi)鈣濃度的增加，可以引起胞內(nèi)鈣庫釋放鈣產(chǎn)生鈣火花，局部的鈣離子濃度升高激活鄰近的BKCa產(chǎn)生STOCs，引起細胞膜的超極化，調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的舒張。STOCs 反應(yīng)了胞內(nèi)鈣火花事件在膜電流上的變化，因此，STOCs是體現(xiàn)BKCa胞內(nèi)鈣敏感性的重要指標(biāo)之一［4-6］。我們之前在實驗中發(fā)現(xiàn)常規(guī)全細胞膜片鉗技術(shù)很難記錄到STOCs 電流,即使有記錄但其持續(xù)時間較短，無法進行藥物調(diào)控研究，而采用全細胞穿孔膜片鉗后記錄到STOCs 電流的概率明顯增加，且可以維持時間長約3h，這可能是由于全細胞穿孔膜片鉗保持了電極內(nèi)液和胞內(nèi)液之間電學(xué)的連續(xù)性，而且使細胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，通道電流的衰減現(xiàn)象顯著減慢，某些對通道調(diào)控和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用的第二信使物質(zhì)仍可發(fā)揮效能，離子通道生理功能保持正常［7］，相對于常規(guī)全細胞膜片鉗技術(shù)實驗成功率更高。值得強調(diào)的是，在實驗過程中為了記到有效的電流，還應(yīng)該注意到膜穿孔物質(zhì)（即兩性霉素B）在電極尖端內(nèi)可能存在沒有溶解的顆粒，這會影響高阻封接的形成；此外兩性霉素B 光敏性高，整個過程均需要注意避光，因此兩性霉素B的充分溶解與避光保存對實驗的成功極為重要。兩性霉素B 難溶于水，要用有機溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide,DMSO）溶解，且電極液中DMSO終濃度不能超過0.3%。需特別注意其電極液的具體配置方法：將l mg 的兩性霉素B 溶解于l0μl DMSO中，置于超聲振蕩器中約15～20min 溶解至橘黃色透明液體后，將5ml 全細胞電極液加入到該溶解液中，用注射器反復(fù)吹打，加速混勻，這樣含兩性霉素B 的全細胞穿孔膜片鉗電極液（終濃度200μg/ml）制備完成，于4℃冰箱保存。有報道新鮮配置的穿孔電極液的有效時間僅為2～3h，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，但是在我們之前的實際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)使用2天后依然有效［7］。

［1］劉振偉.實用膜片鉗技術(shù)［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2006：120-121.

［2］楊艷,曾曉榮,劉智飛，等.酶分離豬冠脈平滑肌細胞鈣激活鉀通道全細胞記錄電學(xué)特性研究［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院院報,2003,26（6）：473-476.

［3］潘雪,李向楠,王鵬，等.RyR 與PKC 在UTP 對豬冠狀動脈平滑肌上STOCs 調(diào)控中的作用［J］.中國老年學(xué)雜志,2010,30（13）1815-1819.

［4］Jaggar JH,PorterVA,Lederer WJ,et al.Calcium sparks in smooth muscle［J］.Am J Physiol Cell Physiol,2000,278（2）：C235-256.

［5］Wellman GC,Nathan DJ,Saundry CM,et al.Ca2+sparks and their function in human cerebral arteries［J］.Stroke,2002,33（3）：802-808.

［6］Furstenau M,Lohn M,Ried C,et al.Calcium sparks in Human coronary artery smooth muscle cells resolved by Confocal imaging［J］.Hypertens,2000,18（9）1215-1222.

［7］李鵬云,曾曉榮,楊艷，等.穿孔膜片鉗技術(shù)在離子通道電流研究中的應(yīng)用［J］.四川生理科學(xué)雜志,2006,28（2）：62-65.