石永春，楊永銀，劉衛(wèi)群

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州文化路95號(hào) 450002

生物技術(shù)

煙草SOC1基因的克隆和表達(dá)分析

石永春，楊永銀，劉衛(wèi)群

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州文化路95號(hào) 450002

為明確SOC1基因在葉片中的生理作用，克隆到煙草中SOC1基因的完整開放閱讀框，全長(zhǎng)806 bp。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草后，獲得26棵轉(zhuǎn)基因植株，其中23棵鑒定為陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)化率為88.46%。與野生型煙草K326相比，獲得的SOC1過表達(dá)煙株開花提前，株高增加，葉片寬大。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，SOC1過表達(dá)不影響葉片中Rubisco大亞基、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶基因的表達(dá)水平，但提高了抗壞血酸氧化酶的表達(dá)水平；提高了碳酸酐酶活性、蔗糖含量和還原性抗壞血酸含量，并降低了抗壞血酸過氧化物酶活性。表明SOC1可能通過影響氧化還原狀態(tài)而提高碳酸酐酶活性和光合速率。

煙草；SOC1；轉(zhuǎn)基因；光合；抗壞血酸

MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面，尤其在生殖器官發(fā)育方面起到重要作用，但也參與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的調(diào)控[1]。SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1（SOC1） 基因?qū)費(fèi)ADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的莖頂端分生組織和葉片中都有表達(dá)，和成花誘導(dǎo)關(guān)系密切[2]。擬南芥中存在四種成花途徑——春化（低溫）、赤霉素、自主途徑和光周期途徑，前三條途徑都通過促進(jìn)莖頂端分生組織中SOC1的表達(dá)[3]激活LEAFY（LFY）基因，最終導(dǎo)致頂端分生組織形成花原基[4]。SOC1基因還與植物對(duì)短期或長(zhǎng)期低溫響應(yīng)的切換密切相關(guān)[5]。

值得注意的是，SOC1也被發(fā)現(xiàn)在葉片中表達(dá)[2]。已發(fā)現(xiàn)在擬南芥的葉片中，光周期通過促進(jìn)CO基因的表達(dá)而增加韌皮部Flowering locus T（FT）蛋白的產(chǎn)量。FT蛋白經(jīng)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)至頂端分生組織中，與Flowering locus D（FD）蛋白一起激活SOC1的表達(dá)并促進(jìn)成花[6]。但在葉片中，SOC1是否與光周期有關(guān)，是否參與葉片生長(zhǎng)的調(diào)控，未見報(bào)道。

煙草是以葉片為收獲對(duì)象的經(jīng)濟(jì)作物，明晰葉片發(fā)育的調(diào)控機(jī)理是獲得優(yōu)質(zhì)煙葉的分子理論基礎(chǔ)。因此，獲得SOC1轉(zhuǎn)基因煙草，不僅是研究SOC1基因在煙葉中生理功能的必要材料，還為研究SOC1是否影響煙葉發(fā)育和品質(zhì)的分子機(jī)理做一鋪墊。本研究對(duì)煙草中的SOC1基因進(jìn)行克隆和轉(zhuǎn)化，并對(duì)SOC1在葉片中的生理作用做一初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草(Nicotiana tabacum cv.K326)種子放在襯有濕潤(rùn)濾紙的平皿里萌發(fā)，而后放在25/16 ℃ day/night的培養(yǎng)間中，每天給予16 h的250 μM m-2·s-1光照。相對(duì)濕度為65%～75%。10 d后，小苗被轉(zhuǎn)入單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)至8葉期，并在上午9點(diǎn)的光照時(shí)間采收檢測(cè)。

菌種Escherichia coli DH5α從大連寶生物公司購(gòu)得，農(nóng)桿菌GV3101和真核表達(dá)載體pROK2由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公 司，Taq酶、RNase抑 制 劑、pMD18-T載 體、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自大連寶生物公司。引物合成和DNA測(cè)序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 NtSOC1的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank上NtSOC1序列（GB：431907）設(shè)計(jì)引物（F：5‘-CTATATTTCCTCATACCTGCAACC-3’；R：5‘-ACACATCCCAGTACAAATCATCTC-3’），RTPCR克隆序列，連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。測(cè)序無誤后，連接真核表達(dá)載體pROK2（載體構(gòu)建如下），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌GV3101（pROK2-SOC1）在添加利福平50 mg/L、卡那霉素50 mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中常規(guī)活化，培養(yǎng)至OD 約為0.6～0.8。將煙草無菌苗葉片的邊緣和葉脈剪去，切成1 cm×2cm大小，在準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中浸泡5 min。用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基，葉面向下于28℃下暗培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化空載體作為對(duì)照。3 d后將葉片轉(zhuǎn)到附加20 mg/L 利福平、300 mg/L頭孢霉素的MS分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行光照培養(yǎng)，每3周繼代培養(yǎng)1次。約1～2月后，將約2 cm高的幼苗轉(zhuǎn)到1/2 MS生根培養(yǎng)基上生根。待根系發(fā)育良好后，移栽到土壤中。

1.2.3 半定量RT-PCR 根據(jù)GenBank公布的煙草（Nicotiana tabacum）SS（AB055497）、SPSC（DQ213014）、DHAR(AY074787)、Rubisco（U35620）、SOC1（431907）、AO（D43624.1）和Actin（AB158612）的mRNA序列，設(shè)計(jì)引物用于RT-PCR擴(kuò)增。RNA的提取參照Trizol試劑盒（Invitrogen）的說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄參考試劑盒（Promega）實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。

1.2.4 酶活性檢測(cè) 碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA）活性測(cè)定按照Hatch[7]的方法進(jìn)行。抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性檢測(cè)參考Vanacker[8]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 物質(zhì)含量檢測(cè) 蔗糖含量檢測(cè)按照蔗糖檢測(cè)試劑盒（Sigma）的說明書進(jìn)行。葉綠素含量檢測(cè)按照Moran[9]的方法進(jìn)行。抗壞血酸按照Takahama[10]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 NtSOC1基因的克隆

按照煙草中SOC1的已知序列在ORF框兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，以煙草葉片cDNA為模板，RT-PCR獲得長(zhǎng)為806 bp的清晰目標(biāo)序列（圖1A），切膠回收后連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑白斑擴(kuò)繁過夜后用菌液PCR的方法進(jìn)行初篩（圖1B），挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆送出測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果（NSC）與目標(biāo)序列（SOC1）比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，二者之間僅有一個(gè)堿基的差異（圖2A）。預(yù)測(cè)所獲片段的氨基酸序列并與NtSOC1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者序列完全一致（圖2B）。從而認(rèn)為克隆到了NtSOC1的完整ORF序列。

圖1 PCR克隆和菌液PCRFig.1 Result of RT-PCR and PCR cloning

圖2 測(cè)序結(jié)果（NSC）與NtSOC1的核酸及氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment between sequencing result （NSC）and NtSOC1 of nuclear acid and amino acid sequences

2.2 NtSOC1的表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

將克隆引物加酶切位點(diǎn)后重新PCR，回收片段并酶切后連接真核表達(dá)載體pRoK2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。菌液PCR初篩后挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，BamHI和Kpn I雙酶切驗(yàn)證（圖3），證明含有克隆序列的真核表達(dá)載體構(gòu)建正確。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

圖3 構(gòu)建載體的酶切驗(yàn)證Fig.3 Identification of constructed vector digested with enzymes

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pRoK2-SOC1轉(zhuǎn)化煙草，誘導(dǎo)成苗（圖4）。PCR檢測(cè)表明，在獲得的26棵轉(zhuǎn)基因材料中，有23棵擴(kuò)增到了35S啟動(dòng)子的序列和SOC1的序列，轉(zhuǎn)化率為88.46 %。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，SOC1過表達(dá)導(dǎo)致煙草株高增加，葉片寬大，開花提前。

圖4 獲得的轉(zhuǎn)基因煙苗Fig.4 Transgenic tobacco seedlings

2.3 SOC1過表達(dá)影響葉片碳代謝和氧化還原狀態(tài)

為明確過表達(dá)SOC1造成煙株形態(tài)學(xué)改變的原因，及SOC1在葉片中的作用，初步調(diào)查了野生型煙草K326和SOC1過表達(dá)植株葉片中光合作用和糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)SOC1過表達(dá)不影響Rubisco大亞基、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPSC）和蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）的表達(dá)水平，但提高了抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AO）的表達(dá)水平（圖5）。

進(jìn)一步的檢測(cè)結(jié)果表明，SOC1過表達(dá)對(duì)葉片中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素濃度影響不大（圖6A），但光合速率（圖6B）、蔗糖含量（圖6C）和碳酸酐酶活性（圖6D）增加。意味著SOC1過表達(dá)促進(jìn)了葉片中CO2的固定和蔗糖的合成。

AO定位于細(xì)胞壁，催化抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）氧化生成單脫氫抗壞血酸，而后自發(fā)歧化生成脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）[11]。AO表達(dá)水平的升高意味著細(xì)胞內(nèi)外氧化還原狀態(tài)可能被改變，為此，檢測(cè)了葉片中的抗壞血酸含量和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）的活性。發(fā)現(xiàn)與野生型煙草相比，SOC1過表達(dá)增加了葉片中的AsA含量，降低了DHA含量（圖6E）；并降低了APX活性（圖6F）；表明SOC1過表達(dá)導(dǎo)致葉片抗壞血酸庫(kù)趨于還原態(tài)。

圖5 野生型煙草（K326）與SOC1過表達(dá)植株（SOC1）葉片中基因表達(dá)的差異Fig.5 Different gene expression levels in leaves of wild type(K326) and SOC1 over-expression tobacco plants (SOC1)

圖6 野生型煙草（K326）與SOC1過表達(dá)植株（SOC1）葉片中光合差異Fig.6 Photosynthetic difference between wild wild type (K326) and SOC1 over-expression tobacco leaves (SOC1)

3 結(jié)論與討論

MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物生殖器官的發(fā)育調(diào)控，近年來，該類轉(zhuǎn)錄因子在營(yíng)養(yǎng)器官生長(zhǎng)調(diào)控方面的作用正逐漸受到關(guān)注。將克隆的NtSOC1構(gòu)建真核表達(dá)載體，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SOC1導(dǎo)致煙草開花提前，與Smykal等[2]獲得的結(jié)果一致。同時(shí)導(dǎo)致株高增加，葉片增大。為明確SOC1過表達(dá)引起形態(tài)學(xué)變化的原因，調(diào)查了轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片中光合作用差異。光合作用的關(guān)鍵酶是負(fù)責(zé)碳固定的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）[12]。在C3 植物中，Rubisco 活性升高提高了葉片對(duì)可溶性CO2的需求，從而影響碳酸酐酶活性。碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)催化CO2+H2O?HCO3-+H+的可逆水合反應(yīng)，能提高葉片中CO2固定效率[13]。光合作用形成的葡萄糖在蔗糖磷酸合成酶（SPS）的催化下形成蔗糖，經(jīng)由韌皮部裝載運(yùn)往庫(kù)組織。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，葉片中過表達(dá)SOC1不影響Rubisco大亞基的表達(dá)水平，也不影響負(fù)責(zé)合成蔗糖的蔗糖磷酸合成酶（SPSC）和負(fù)責(zé)降解蔗糖的蔗糖合成酶（SS）的表達(dá)水平（圖5）。但提高了葉片中的光合速率、碳酸酐酶活性和蔗糖含量（圖6）。表明過表達(dá)SOC1提高了葉片中的光合作用和蔗糖含量，可能與碳酸酐酶的活性增加密切相關(guān)。

碳酸酐酶的活性受細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控[14]，故而檢測(cè)了葉片中抗壞血酸相關(guān)酶的表達(dá)水平或活性變化。發(fā)現(xiàn)生型煙草K326相比，過表達(dá)SOC1提高了葉片中AO的表達(dá)水平，降低了APX活性，并使葉片中的還原型抗壞血酸（AsA）濃度增加，氧化性抗壞血酸（DHA）濃度降低（圖6）。AO定位于細(xì)胞壁，催化抗壞血酸與氧反應(yīng)生成單脫氫抗壞血酸[15]，APX以抗壞血酸為氫供體，清除H2O2。葉片中總抗壞血酸含量的增加和APX活性的降低，意味著過表達(dá)SOC1影響了葉片中抗壞血酸庫(kù)的氧化還原狀態(tài)，使之趨于還原態(tài)。從而可能提高光合作用，促進(jìn)葉片生長(zhǎng)。

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Cloning and expression of SOC1 gene in tobacco

SHI Yongchun,YANG Yongyin,LIU Weiqun
College of Life Science,Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002,China

Open reading frame of SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1 (SOC1) gene in tobacco was cloned with full length of 806 bp to investigate its physiological function in tobacco.Agrobacterium-mediated leaf-disk transformations were used to create 26 SOC1 transgenic tobacco plants.Among which 23 were identified as positive plants with transformation rate of 88.46%.Compared with tobacco variety K326,SOC1 over-expression plants had early floral time,higher plant heights and wider and longer leaves.Semi-quantitative RT-PCR results showed that over-expression of SOC1 did not affect expression levels of Rubisco large subunit,sucrose phosphate synthetase and sucrose synthetase in leaves,but increased the level of ascorbare oxidase.It also increased carbonic anhydrase activity,concentrations of sucrose and ascorbic acid,and reduced ascorbate peroxidase activities.These results suggested that SOC1 increase carbonic anhydrase activity and photosynthesis by changing ascorbate redox state.

tobacco; SOC1; transgene; photosynthetic; ascorbic acid

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.02.017

Q78；S572.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1004-5708(2014)02-0099-05

河南省煙草公司科技項(xiàng)目（HYKJ201005）

石永春（1978—），副教授，主要從事煙草生理生化研究，Email：shiyongchun369@126.com

劉衛(wèi)群（1956—），博士，教授，主要從事煙草生理生化研究，Email：liuweiqun2004@126.com

2013-04-22