高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，楊愛國，程立銳，代帥帥

煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101

Beinhart1000-1抗赤星病基因的QTL定位

高亭亭，蔣彩虹，羅成剛，楊愛國，程立銳，代帥帥

煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101

為探索Beinhart1000-1的赤星病抗性遺傳規(guī)律，以抗赤星病品種Beinhart1000-1為母本，感病品種G140為父本，構(gòu)建F1及F2代群體，篩選與抗性基因緊密連鎖的SSR標記，并進行抗性基因的QTL定位。結(jié)果表明，Beinhart1000-1的赤星病抗性由顯性基因控制。同時利用混合群體分組分析法，從2653對SSR引物中，得到83對在抗感池間表現(xiàn)多態(tài)且擴增條帶穩(wěn)定清晰的SSR標記。以F2代群體115個單株為作圖群體，利用該83對引物進行擴增，經(jīng)WinQTLCart2.5分析，構(gòu)建了83個標記的遺傳連鎖圖譜，獲得2個抗赤星病QTL位點，分別位于7號和15號連鎖群上。

煙草; Beinhart1000-1；赤星病; SSR; QTL定位

煙草赤星病是嚴重制約我國煙葉生產(chǎn)的一類真菌病害，該病具有潛育期短，爆發(fā)快的特點，在溫濕度適宜的條件下，短時間內(nèi)即可大面積流行，給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失[1-2]。雪茄煙品種Beinhart1000-1高抗赤星病，是抗病育種的優(yōu)良抗源，對其抗性進行深入研究具有重要意義。

近幾年來，為了快速有效的選擇優(yōu)良植株，國內(nèi)外廣泛應用了分子標記技術(shù)：尋找與優(yōu)良性狀緊密連鎖的分子標記，然后利用這些標記去栽培群體中選擇優(yōu)良單株，從而提高育種效率、縮短育種年限。分子標記中的SSR（Simple sequence repeats）標記具有重復穩(wěn)定性好的特點，但是由于SSR標記引物的開發(fā)比較緩慢，限制了其在煙草研究中的應用。直到Bindler等公開發(fā)表了高密度的煙草遺傳連鎖圖譜，包括2300多對SSR引物[3-4]，SSR標記在煙草上的應用才有了長足發(fā)展。

目前，國內(nèi)對Beinhart1000-1的赤星病抗性研究還非常有限，其抗性遺傳潛力很大。隨著分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，對該品種的研究也在不斷深入。

本研究旨在篩選與Beinhart1000-1的赤星病抗性基因緊密連鎖的SSR標記，分析Beinhart1000-1赤星病抗性遺傳規(guī)律，將其抗性基因進行QTL定位，研究親本來源不同時，抗性基因遺傳位點的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

母本為抗赤星病品種Beinhart1000-1，父本為感病品種G140，兩者都由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所遺傳育種研究中心提供，由它們雜交獲得(Beinhart1000-1×G140)F1，自交獲得F2代分離群體。

1.1.2 煙草赤星病菌

用于接種鑒定的赤星病菌由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所植物保護研究室提供。

在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上接種煙草赤星病菌，然后將其在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約兩周。當菌絲體基本長滿培養(yǎng)基時取出，在培養(yǎng)皿中倒入無菌水，浸泡約5 min后刮下菌絲體，加入蒸餾水，配成孢子濃度約為1xl06/mL的懸浮液[5]，備用。

1.1.3 SSR引物

所用SSR引物來自Bindler[6]公開發(fā)表的煙草SSR連鎖圖及其引物序列，且標記所在連鎖群已知。由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。用超純水將引物粉末稀釋為10 μmol/L的工作濃度備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液接種方法

試驗采用劃傷懸滴法接種。抗病對照為Beinhart l000-l，感病對照為G140。在煙葉成熟期，每株煙選取兩片底部長勢相近的葉片接種，在每片用于接種的葉子的主脈兩側(cè)用接種針均勻地劃6個十字劃傷，在每個傷口處懸滴一滴接種菌液，接種后將接種葉片套上透明塑料袋，以保持溫濕度。接種7 d后，劃傷周圍開始出現(xiàn)侵染癥狀，接種14 d發(fā)病癥狀明顯。接種后20 d時，調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。

1.2.2 病情統(tǒng)計標準[5]

單株調(diào)查分級標準：0級：全部劃傷無侵染；l級：有25%的劃傷形成病斑，但不擴展；2級：有50%的劃傷形成病斑，且稍有擴展；3級：80%的劃傷形成病斑，且有明顯擴展；4級：100%的劃傷有侵染，且形成很大病斑，被侵染處形成壞死斑。

群體抗性劃分標準：免疫：病級數(shù)為0級；高抗：病級數(shù)為1級；中抗：病級數(shù)為2級；中感：病級數(shù)為3級；高感：病級數(shù)為4級。

其中，0級、1級和2級劃分為抗病群體，3級和4級劃分為感病群體。

病情指數(shù)=[(病級代表值x該級葉片數(shù))/(調(diào)查總?cè)~片數(shù)/最高級代表)]x100

1.2.3 DNA的提取及抗感池的建立

采用稍加改良的CTAB 法提取煙草總基因組DNA[7]，利用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提DNA的質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗感池的建立：在抗性鑒定之后，從 F2代分離群體中分別選取10株感病單株和 10 株抗病單株，將其 DNA 分別等量混勻組成抗感池。

1.2.4 PCR擴增反應和電泳檢測

PCR 反應體系[8]總體積為10 μL，其中30～50 ng/μL的DNA模板1 μL、5 μmol/L正反向引物各 1 μL，2×Mix 5 μL，H2O 2 μL。所用試劑購自MBI。

PCR 反應在 96 孔ABI Veriti型多梯度PCR儀上運行[9]：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共 35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。其中，退火溫度根據(jù)引物序列不同略作調(diào)整。

PCR 反應結(jié)束后，取3 μL PCR 產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒電壓1000 v 電泳1.5 h左右。用改進的 NaOH銀染方法[10]對電泳后的聚丙烯酰胺凝膠進行染色顯影。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

首先使用MAPMAKER軟件包，利用供試F2群體的SSR標記基因型數(shù)據(jù)，構(gòu)建遺傳連鎖圖。然后結(jié)合遺傳連鎖圖譜和表型鑒定數(shù)據(jù)，應用WinQTLCart2.5軟件進行QTL定位，其中permutation times設為1 000，LOD閾值設定為≥2.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料赤星病抗性鑒定結(jié)果

抗性鑒定結(jié)果表明：Bcinhartl000-l的病情指數(shù)為9.7，表現(xiàn)為抗??；G140的病情指數(shù)為66，表現(xiàn)為感??；F1代病情指數(shù)為38.4，表現(xiàn)為中抗（表1）。據(jù)此推測，Beinhartl000-l對赤星病的抗病性是由顯性基因控制的。

表1 供試煙草材料接種赤星病菌后發(fā)病情況調(diào)查表Tab.1 Disease observation of tobacco materials inoculated with the brown spot

2.2 煙草赤星病抗性遺傳分析

大田條件下，對F2代分離群體進行赤星病的抗性鑒定。根據(jù)上面試驗方法中提到的病情劃分標準，將其病級劃分為 0～4 級 5 個級別，統(tǒng)計結(jié)果如圖1。由圖可知，F(xiàn)2代群體的病情分布情況基本符合正態(tài)分布規(guī)律，結(jié)合往年田間試驗觀察及Beinhart1000-1的自身抗性表現(xiàn)，預測Beinhart1000-1對赤星病的抗性由多基因控制。

圖1 F2群體單株病情分布圖Fig.1 The resistance identification of seedling in F2 generation

2.3 抗性基因的SSR標記篩選

以抗感親本及F1的DNA為模板進行PCR擴增，篩選了分布于24條連鎖群上的2 653對SSR引物，共篩選得到184對多態(tài)性引物，多態(tài)比率為6.9%。采用Michelmore等[11]提出的分離群體分組分析(BSA)法，將篩選到的多態(tài)性SSR引物在抗感池間進行PCR 擴增，并將PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色。從184對SSR引物中挑選出了83對擴增穩(wěn)定且多態(tài)性顯著的引物。

圖2 引物M653在部分F2分離群體中的擴增效果Fig.2 Polymorphism produced by M653 primer among the partial F2 plants

2.4 赤星病抗性基因的QTL定位分析

應用該83對引物對抗性鑒定完畢的115株F2單株進行PCR擴增，再利用基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，如圖3所示。共得到18個連鎖群，圖譜全長1014.70 cm，包含72個標記位點，平均每個連鎖群上有4個SSR標記，標記間平均遺傳距離為14.09 cm，另外有11個標記未能連鎖到該圖譜上。

根據(jù)構(gòu)建的遺傳圖譜，利用復合區(qū)間作圖法對煙草赤星病的抗性QTL進行定位分析，共檢測到兩個QTL位點：一個位于7號連鎖群上，在標記M122與M935之間，其峰值LOD為3.3688，貢獻率為15.9%，加性效應0.0571，暫將其命名為RBS-1，則RBS-1與標記M935間的遺傳距離為7.4 cm；另外一個QTL位于15號連鎖群上，在標記M524與M653之間，其峰值LOD為3.1358，貢獻率為14.4%，加性效應-0.1302，暫將其命名為RBS-2，則RBS-2與標記M653間的遺傳距離為9.8 cm。定位分析最終結(jié)果如表2。

圖3 基于SSR的遺傳連鎖圖譜Fig.3 Genetic linkage map based on SSR markers

表2 QTL定位分析結(jié)果Tab.2 Results of QTL analysis

3 討論

目前種植的高抗赤星病的煙草品種較少，而雪茄煙品種Beinhart1000-1是公認的抗赤星病育種的良好抗源，對其進行深入細致的研究對有效利用該抗源進行抗病品種的選育具有重要意義。

有研究認為Beinhartl000-1的赤星病抗性是由單基因控制的部分顯性遺傳[12-13]；還有研究認為Beinhartl000-1的赤星病抗性都是由多基因控制的[14-15]；郭永峰等[16-17]則認為Beinhartl000-1的赤星病抗性為顯性多基因控制的水平抗性。本研究推測Beinhart1000-1對赤星病的抗性由顯性多基因控制，與前人的研究有一定的差異[5-6,12-18]，這可能是由于親本材料的選擇、抗性鑒定株系、病菌接種方法和實驗環(huán)境等的不同導致的實驗結(jié)果出現(xiàn)差異。

蔣彩虹等[18]曾在2007年篩選到一個與Beinhartl000-1的赤星病抗性基因相連鎖的SRAP標記，遺傳距離為16.0 cm。本研究應用的是SSR引物，來自2011年Bindler[6]公開發(fā)表的高密度連鎖圖譜，覆蓋整個煙草基因組，要比蔣彩虹等人所用的SRAP引物穩(wěn)定重復性好，且數(shù)量更大，密度也更高。此外，本實驗是利用WinQTLCart2.5軟件對實驗所得基因型數(shù)據(jù)與表型數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果更為可靠。目前針對赤星病抗性基因的QTL定位研究較少，本研究利用煙草高密度遺傳連鎖圖譜定位到兩個QTL，分別位于7號和15號連鎖群上，與目的基因間的遺傳距離分別為7.4 cm和9.8 cm，這進一步表明Beinhartl000-1對赤星病的抗病性由多基因調(diào)控，而且這兩個QTL分別與標記M935和M653連鎖，在分子標記輔助育種中具有一定的應用價值。

4 結(jié)論

利用赤星病抗、感親本篩選得到的多態(tài)SSR引物，對F2群體單株進行擴增，找到兩個與赤星病抗性基因緊密連鎖的QTL：其中一個存在于7號連鎖群上，與標記M935間的遺傳距離為7.4 cm，貢獻率為15.9 %；另外一個位于15號連鎖群上，與標記M653間的遺傳距離為9.8 cm，貢獻率為14.4 %。并推測Beinhart1000-1對赤星病的抗病性由顯性多基因控制。

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Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to brown spot in tobacco line Beinhart1000-1

GAO Tingting,JIANG Caihong,LUO Chenggang,YANG Aiguo,CHENG Lirui,DAI Shuaishuai
Key Laboratory for Tobacco Gene Resources,Tobacco Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao 266101,Shandong，China

F1and F2populations were constructed from a cross between Beinhart1000-1 and susceptible variety G140 to study the genetic basis of resistance to brown spot in tobacco cigar line,Beinhart1000-1,and to identify genomic locations contributing to resistance.Inheritance of resistance to brown spot was analyzed in F1and F2populations.Results shown that resistance to brown spot in Beinhart1000-1 was controlled by dominance genes.A population of 115 F2was further used for QTL mapping with 83 SSR markers.Two QTLs,RBS-1 and RBS-2,were discovered on No.7 and 15 genetic linkage groups through composite interval mapping method.The major QTL,RSB-1,was flanked by marker M935 with genetic distance of 7.4 cm and accounted for 15.89% of phenotypic variance.Other major QTL,RBS-2,was flanked by marker M653 with genetic distance of 9.8 cm and accounted for 14.42% of phenotypic variance.These results could facilitate our understanding of inheritance of resistance to brown spot in tobacco by marker-assisted selection.

tobacco; Beinhart1000-1; tobacco brown spot; SSR; QTL analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.02.018

S47; Q78 文獻標志碼： A 文章編號：1004-5708(2014)02-0104-04

國家煙草專賣局項目(110201002002)；四川省煙草公司科技項目（201101004）

高亭亭（1987—），碩士，主要從事作物遺傳育種研究，Email：gaotingting111@163.com

蔣彩虹（1972—），助理研究員，主要從事煙草遺傳育種研究，Email：jiangcaihong@caas.cn

2013-07-05