謝瓊 盧月月 易宏鋒

2型糖尿病(T2DM)是由遺傳因素及環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復(fù)雜疾病，是一組異質(zhì)性疾?。?］。相關(guān)研究報(bào)道人群中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)增加T2DM遺傳易感性的是Calpain 10基因，位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的NIDDM1區(qū)［2-3］。Calpain 10基因和歐美人群的 T2DM的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)［4-5］。本文探討T2DM基因中的SNP43及SNP19這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與漢族人群T2DM遺傳易感性之間的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇我院2009年1月至2012年12月T2DM患者262例為試驗(yàn)組，男161例，女101例，年齡25～72歲，平均(60.7±10.9)歲;血糖正常者262例為對(duì)照組，男112例，女150例，年齡25～72歲，平均(50.1±9.4)歲。T2DM患者入院后經(jīng)相關(guān)血清學(xué)測(cè)定證實(shí)抗胰島細(xì)胞抗體(ICA)和抗谷氨酸脫羧酶抗體(GAD)陰性。T2DM診斷采用國(guó)際上通用的WHO糖尿病專家委員會(huì)(1999)提出的診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組來(lái)自我院體檢中心篩選出的健康體檢者，共262例，經(jīng)口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)除外糖尿病患者，排除糖尿病家族史者。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取和擴(kuò)增:采用石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)進(jìn)行抽提組織DNA。提取物可直接用作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Calpain 10基因第3個(gè)內(nèi)含子內(nèi)包含SNP43多態(tài)性和SNP19多態(tài)性的DNA片段。SNP43引物序列F:CAC GCT TGC TGT GAA GTA ATGC;R:CTC TGA TTC CCA TGG TCT GTA G;SNP19引物序列F:GTT TGG TTC TCT TCA GCGTGG AG;R:CAT GAA CCC TGG CAG GGT CTAAG。

1.2.2 多態(tài)性的檢測(cè):SNP43多態(tài)性的檢測(cè)采用PCR-RFLP方法，PCR產(chǎn)物經(jīng)Nsi1內(nèi)切酶經(jīng)37℃水浴16h消化后，行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后讀取基因型。SNP19多態(tài)性的檢測(cè)采用PCR產(chǎn)物直接行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后讀取基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型分析 SNP43多態(tài)性的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為151 bp，此序列內(nèi)單個(gè)堿基的G-A突變使ATGCGT變?yōu)锳TGCAT，PCR產(chǎn)物可被酶解成121個(gè)堿基和23個(gè)堿基的2個(gè)片段。電泳后在DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物142 bp附近出現(xiàn)條帶的基因型為野生型純合子GG，在142 bp與102 bp之間出現(xiàn)條帶的基因型為突變的純合子AA，同時(shí)在2個(gè)部位均出現(xiàn)條帶的基因型為雜合子GA。任選4份樣品測(cè)序，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.2 基因多態(tài)性分析 SNP43多態(tài)性和SNP19多態(tài)性的等位基因在各組研究對(duì)象中的分布比較分析顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，SNP43位點(diǎn)等位基因G頻率顯著升高(P＜0.05)，GG基因型頻率亦顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1。SNP19位點(diǎn)等位基因，見(jiàn)表2。

表1 2組SNP43位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較

表2 2組SNP 19位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較

3 討論

3.1 SNP位點(diǎn)基因易感性 在國(guó)內(nèi)的湖北漢族人群T2DM的研究試驗(yàn)中，T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與CDKAL1、CDKN2A/B等基因上的若干個(gè)SNP位點(diǎn)呈顯著相關(guān)性。IGF2BP2和SLC30A8基因上的遺傳變異，會(huì)增加空腹血糖受損的風(fēng)險(xiǎn)［6-8］。糖尿病相關(guān)數(shù)量性狀分析結(jié)果顯示，這些易感SNP位點(diǎn)與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平，尤其是與胰島B細(xì)胞功能之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。這些在中國(guó)漢族人群中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，對(duì)T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有疊加性。目前，已經(jīng)報(bào)道的T2DM基因易感位點(diǎn)有近60個(gè)，但是絕大多數(shù)都是在歐美和其他亞洲人群中發(fā)現(xiàn)的［9-10］。我國(guó)近30年來(lái)T2DM的患病率逐年快速增加，現(xiàn)有研究表明包括中國(guó)漢族人群在內(nèi)的東亞人群對(duì)T2DM的易感性顯著高于西方人群，但是其遺傳學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚。

3.2 G/A多態(tài)性與糖尿病 本研究中T2DM患者與對(duì)照組相比，SNP43位點(diǎn)等位基因(G)和基因型(GG)的頻率顯著升高，說(shuō)明湖北漢族人群基因中SNP43位點(diǎn)G/A多態(tài)性與T2DM發(fā)病相關(guān)，此項(xiàng)研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道相符。除此之外，本研究提示，SNP19等位基因位點(diǎn)的G/A基因和GG基因型在T2DM中分布頻率和正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異，提示Calpain 10基因的SNP19位點(diǎn)等位基因頻率與T2DM患者的發(fā)病不相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有關(guān)IRE1a基因變異性與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)研究報(bào)道，也未見(jiàn)關(guān)于IRE1a與IGR發(fā)病機(jī)制的研究。推測(cè)其可能的機(jī)制為:己知IRE1a是影響UPR通路的重要信號(hào)分子，有研究觀察到與IGR風(fēng)險(xiǎn)或胰島素分泌水平相關(guān)的SNP可能影響基因mRNA的表達(dá)，從而影響蛋白的表達(dá)或蛋白的功能，進(jìn)而干擾胰島B細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞凋亡，影響胰島素分泌的功能，雖然相關(guān)SNPs均位于內(nèi)含子［11-13］。但有研究證實(shí)內(nèi)含子具有調(diào)節(jié)基因(如Calpain 10)表達(dá)的作用;其次，它們有可能只是一個(gè)遺傳標(biāo)記，可能存在與其呈高度連鎖不平衡的影響IRE1a mRNA或蛋白表達(dá)的成因變異。增齡本身是糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)因素，隨著年齡的增長(zhǎng)胰島B細(xì)胞的功能進(jìn)行性下降，因此，從機(jī)制上年齡和風(fēng)險(xiǎn)等位基因在對(duì)胰島B細(xì)胞功能的影響上有協(xié)同作用，共同參與糖尿病的易感性［14］。

這些研究成果不僅為解析與T2DM易感性相關(guān)的致病基因的結(jié)構(gòu)、基因功能和生物學(xué)機(jī)制、種族間的差異奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ);而且該項(xiàng)目所建立的人群數(shù)據(jù)庫(kù)和生物樣本庫(kù)也將為揭示調(diào)控致病基因的主要營(yíng)養(yǎng)和其他環(huán)境因素，發(fā)展和建立對(duì)高危個(gè)體的預(yù)測(cè)模型提供了研究平臺(tái)。本項(xiàng)目的完成對(duì)建立符合中國(guó)人特點(diǎn)的T2DM的早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系和個(gè)體化干預(yù)策略，推動(dòng)我國(guó)在該領(lǐng)域的研究進(jìn)入國(guó)際前沿，具有重要意義。

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