劉瑜 趙玉生 吳寧 楊翔 萬文輝 錢曉明

2型糖尿病(T2DM)是以機體胰島素抵抗或胰島B細胞功能障礙為特征的一種常見的慢性代謝性疾病［1］。Yang等［2］在 2010年報道，我國糖尿病患者已超過9200萬，其中＞90%是T2DM，給社會造成嚴重的醫(yī)療負擔。T2DM發(fā)病機制復雜，家族聚集性患病提示遺傳因素在T2DM發(fā)病中具有重要作用［3-4］。識別T2DM的易感基因，對高危人群進行早期干預，是防治T2DM的有效措施之一。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)屬于核受體超家族成員，其活化后能在細胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種基因的表達，在調(diào)節(jié)糖、脂代謝中具有重要作用［5］。既往國內(nèi)外有研究表明PPARγ基因變異可能與肥胖和T2DM有關(guān)，但研究大多集中在PPARγ基因中少數(shù)功能位點，且研究結(jié)果還有爭議。本研究以中國北方漢族人為研究對象，觀察PPARγ基因中常見13個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點與T2DM易感性的關(guān)系，為深入探討T2DM發(fā)病機制及風險預測提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象 連續(xù)收集中國人民解放軍總醫(yī)院健康體檢中心2012年6～8月的體檢患者167例，其中T2DM患者40例，對照組127例。年齡均＞18歲、漢族、籍貫為北京及其周邊地區(qū)(天津、河北、山西、內(nèi)蒙古)，相互間無生物學親緣關(guān)系，既往無甲狀腺功能亢進、垂體疾病、重要臟器功能衰竭;未服用影響糖代謝的藥物及非孕婦。T2DM的診斷依據(jù)患者的既往史和此次體檢結(jié)果(采用2010年美國糖尿病協(xié)會診斷標準)并進行谷氨酸脫羧酶抗體和胰島細胞抗體的檢測，以排除1型糖尿病。對照組均經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗證實無糖尿病存在。對167例受試對象采空腹靜脈血4 ml，EDTA抗凝，-80℃凍存以備后續(xù)提取基因組DNA。收集受試對象年齡、性別、身高、體質(zhì)量、吸煙、飲酒、腰圍、臀圍、既往病史等資料，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、腰臀比。所有受試者均簽署知情同意書。本實驗通過了中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會的審核。

1.2 SNPs位點的選擇及基因分型 采用3種方法選擇 SNPs位點。首先在 Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)上查閱已發(fā)表的有關(guān) PPARγ基因多態(tài)性與T2DM相關(guān)性研究的文獻，找到有陽性結(jié)果的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，且在漢族人群中的次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)＞20%;其次查閱 NCBI的 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，找到位于PPARγ基因功能區(qū)(外顯子、3'及5'非翻譯區(qū))的 SNPs，且在漢族人群中的 MAF＞20%;最后從 HapMap 數(shù)據(jù)庫(http://www.hapmap.org)中選擇北京漢族人群樣本，以 r2＞0.8，MAF＞20%作為條件，得到標簽SNPs(Tag SNPs)，最終得到13個SNPs(表1)。采用德國QIAGENTM試劑盒提取外周靜脈血DNA?；蚍中筒捎蒙虾Ｌ礻簧锟萍加邢薰靖牧嫉倪B接酶檢測反應(ligase detection reaction，LDR)分型方法。根據(jù)dbSNP數(shù)據(jù)庫提供的基因組序列設(shè)計引物和探針。PCR過程中設(shè)置陰性對照。實驗結(jié)束后隨機雙盲挑取20個標本進行重復性檢驗，重復率達100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)每個 SNP位點的基因型頻率，進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用非條件Logistic回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒后，在不同的遺傳模式下，分析各基因型與T2DM易感性是否存在關(guān)聯(lián)，計算P值、比值比(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)。所有統(tǒng)計均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

表1 PPARγ基因SNP位點信息

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料 共納入167名體檢患者，年齡20～80歲，平均(51.20±15.39)歲，其中男 95 例，平均(51.81±14.55)歲;女 72例，平均(50.40±16.50)歲。T2DM患者(病例組)40例，男24例，女16例，年齡26～77歲，平均(57.70±12.03)歲。對照組127例，男71例，女 56例，年齡 20～80歲，平均(49.16±15.80)歲，病例組較對照組年齡偏大，血壓、腰臀比和BMI偏高，且伴有更高的高血壓、冠心病、高脂血癥患病率。見表2。

表2 2組基礎(chǔ)資料比較

2.2 PPARγ基因多態(tài)性與T2DM易感性的相關(guān)性所有位點在病例和對照組中的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。校正年齡、性別、吸煙、飲酒后，非條件Logistic回歸分析顯示，rs2972164在顯性模型中與T2DM發(fā)病風險相關(guān)，CT+TT較CC能夠降低T2DM發(fā)病風險(OR=0.21，95%CI:0.04～0.99，P=0.049)，CT較CC有降低T2DM發(fā)病風險的趨勢(OR=0.21，95%CI:0.04～1.03，P=0.050)。見表3。

表3 PPARγ基因rs2972164位點基因型在2組中的頻率及與T2DM的相關(guān)性(n，%)

3 討論

人類PPARγ基因定位于人染色體3p25-24，由于轉(zhuǎn)錄起始點和剪接方式的不同產(chǎn)生4種異構(gòu)體PPARγ1～4。PPARγ1廣泛表達于機體組織細胞、PPARγ2主要表達于脂肪組織、PPARγ3主要表達于巨噬細胞和結(jié)腸，而對PPARγ4的表達目前還知之甚少［6］。PPARγ與配體結(jié)合而被激活，通過與維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異源二聚體在細胞核內(nèi)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，在糖、脂代謝中具有重要作用［5］。臨床中，羅格列酮等噻唑烷二酮類藥物能夠通過激活PPARγ促進脂肪組織分泌脂聯(lián)素，增加機體對胰島素的敏感性，臨床已用來治療T2DM［7］。PPARγ基因變異能夠通過改變PPARγ的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能來影響機體對葡萄糖的代謝。因此，本文以PPARγ基因為候選基因，采用病例對照的研究設(shè)計探討我國北方漢族人群 PPARγ基因上 13個常見 SNPs位點與T2DM的相關(guān)性，在校正年齡、性別、吸煙、飲酒狀態(tài)后，首次發(fā)現(xiàn)在中國北方漢族人群中rs2972164多態(tài)與T2DM相關(guān)，CT/CT+TT基因型者較CC型T2DM的發(fā)病風險降低，提示該位點的變異對T2DM發(fā)病具有保護作用。

既往國內(nèi)外對PPARγ基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性研究主要集中在少數(shù)功能位點上，其中最常見是rs1801282。rs1801282是位于PPARγ基因外顯子1上的一個非同義突變(CCA-GCA)，導致其編碼的第12位氨基酸由脯氨酸變?yōu)楸彼?Pro12Ala)。該多態(tài)在不同人群中報道的發(fā)生率不一，波動在2%～25%，亞洲人群的發(fā)生率顯著低于白種人［8］。本研究中，12Ala在T2DM組的頻率為10.00%，對照組為7.87%，其在對照組中的頻率與 Wang 等［9］(7.2%)和 Shi等［10］(7.9%)的報道相似。既往有研究表明，Pro12Ala突變與肥胖、T2DM、脂質(zhì)代謝有關(guān)，但結(jié)果隨著研究人群或方法的不同而不同，所得的結(jié)論還有爭議。Deeb等［11］首先在日裔美國人中報道了Pro12Ala與T2DM相關(guān)，Altshuler等［12］在大樣本北歐人群中得到了相似的結(jié)果。但對意大利人、波蘭人等的研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與T2DM無關(guān)，還有一些研究則提示該多態(tài)能夠增加T2DM風險。造成這種差異的原因考慮與Pro12Ala在不同種族人群中的發(fā)生率不同，以及各研究納入對象的年齡、性別、生活習慣、環(huán)境和地域的差別等有關(guān)。國內(nèi)對Pro12Ala基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性也做了大量的研究。郭烏蘭等［13］對中國漢族人群PPARγ基因Pro12Ala與T2DM的相關(guān)性進行了Meta分析，共納入文獻17篇，包括T2DM 3927例，正常對照3364例;其中有2篇報道Pro12Ala與T2DM相關(guān)，其余15篇均未顯示相關(guān)性，Meta分析結(jié)果表明中國漢族人群Pro12Ala與T2DM無顯著相關(guān)性。同樣，本研究中也未發(fā)現(xiàn)Pro12Ala與T2DM相關(guān)。

由于T2DM是復雜疾病，許多基因和變異與其相關(guān)，我們沒有像既往研究只選擇PPARγ基因中少數(shù)功能位點進行研究，而是選擇了更廣范圍的SNPs位點，最大程度地代表了PPARγ基因上的常見遺傳信息，這些位點中的大多數(shù)在既往關(guān)聯(lián)研究中都未見報道。rs2972164是位于PPARγ基因內(nèi)含子1中的SNP位點。有關(guān)該位點與疾病的相關(guān)性研究既往報道很少。Peters等［14］報道rs2972164與不同個體對他汀類藥物的治療反應相關(guān)。理論上，那些位于外顯子導致氨基酸變化的非同義突變及位于啟動子和剪切部位的突變導致疾病或表型異常的可能性較大，但由于自然選擇的原因，它們在人群中頻率較小，需要較大的樣本量［15］。目前已發(fā)現(xiàn)許多與疾病相關(guān)的遺傳標記位于非編碼區(qū)或基因沙漠［16］。但也不排除rs2972164因與其他和T2DM相關(guān)的SNPs位點連鎖，而表現(xiàn)出與T2DM相關(guān)。因此，rs2972164與T2DM的相關(guān)性還需要擴大樣本量進行重復性驗證。

因為本研究樣本量較少，一些低外顯率的SNPs位點的效應發(fā)現(xiàn)不了。SNPs位點是從dbSNP數(shù)據(jù)庫和HapMap數(shù)據(jù)庫中選擇，隨著不斷有新的SNPs位點發(fā)現(xiàn)，這兩個數(shù)據(jù)庫還在不斷完善中，因此所選擇的位點并不能代表PPARγ基因中所有的遺傳變異信息，不排除該基因中還有其他位點與T2DM相關(guān)。本研究結(jié)果還需要在另一獨立人群中擴大樣本量來進一步驗證。

［1］Stumvoll M，Goldstein BJ，van Haeften TW.Type 2 diabetes:principles of pathogenesis and therapy ［J］.Lancet，2005，365(9467):1333-1346.

［2］Yang W，Lu J，Weng J，etal.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12):1090-1101.

［3］Bonnefond A，F(xiàn)roguel P，Vaxillaire M.The emerging genetics of type 2 diabetes［J］.Trends Mol Med，2010，16(9):407-416.

［4］Frayling TM.Genome-wide association studies provide new insights into type 2 diabetes aetiology ［J］.Nat Rev Genet，2007，8(9):657-662.

［5］蔡輝.過氧化物酶體增殖物激活受體γ與動脈粥樣硬化的研究進展［J］.醫(yī)學研究生學報，2011，24(10):1099-1102.

［6］Abbott BD.Review of the expression of peroxisome proliferator-activated receptors alpha(PPAR alpha)，beta(PPAR beta)，and gamma(PPAR gamma)in rodent and human development［J］.Reprod Toxicol，2009，27(3/4):246-257.

［7］Kintscher U，Law RE.PPARgamma-mediated insulin sensitization:the importance of fat versus muscle［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，288(2):E287-E291.

［8］Jeninga EH，Gurnell M，Kalkhoven E.Functional implications of genetic variation in human PPARγ［J］.Trends Endocrinol Metab，2009，20(8):380-387.

［9］Wang F，Han XY，Ren Q，etal.Effect of genetic variants in KCNJ11，ABCC8，PPARG and HNF4A loci on the susceptibility of type 2 diabetes in Chinese Han population［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(20):2477-2482.

［10］Shi H，Yu X，Li Q，etal.Association between PPAR-γ and RXR-αgene polymorphism and metabolic syndrome risk:a case-control study of a Chinese Han population［J］.Arch Med Res，2012，43(3):233-242.

［11］Deeb SS，F(xiàn)ajas L，Nemoto M，etal.A Pro12Ala substitution in PPARgamma2 associated with decreased receptor activity，lower body mass index and improved insulin sensitivity［J］.Nat Genet，1998，20(3):284-387.

［12］Altshuler D，Hirschhorn JN，Klannemark M，etal.The common PPARgamma Pro12Ala polymorphism is associated with decreased risk of type 2 diabetes ［J］.Nat Genet，2000，26(1):76-80.

［13］郭烏蘭，唐勇，韓學堯，等.中國漢族人群過氧化酶體增殖物激活受體γ基因Pro12Ala多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)性的Meta分析［J］.中國糖尿病雜志，2011，19(7):483-488.

［14］Peters BJ，Pett H，Klungel OH，etal.Genetic variability within the cholesterol lowering pathway and the effectiveness of statins in reducing the risk of MI［J］.Atherosclerosis，2011，217(2):458-464.

［15］Lalouel JM，Rohrwasser A.Power and replication in casecontrol studies［J］.Am J Hypertens，2002，15(2 Pt 1):201-205.

［16］高鵬，吳江，杜丹華，等.過氧化物酶增殖物激活受體γ2基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性［J］.中國實驗診斷學，2010，14(8):1189-1191.