陸春波，穆 琳，蔡文金

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310020）

復合維生素B注射液為復方制劑，主要用于防治維生素缺乏所致的多發(fā)性神經(jīng)炎，消化障礙，癩皮病，口腔炎等。復合維生素B注射液收載于農(nóng)業(yè)部1960號公告［1］，該標準只對維生素 B1、核黃素磷酸鈉的含量進行了測定，其中維生素B1測定方法為重量法，核黃素磷酸鈉測定方法為紫外-可見分光光度法。本研究在參考文獻［2-4］的基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜法同時測定本品中維生素B1、核黃素磷酸鈉、維生素B6、煙酰胺含量的方法，結(jié)果較為滿意。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜，配Waters 2487紫外檢測器（美國Waters公司）；XS-205電子天平（Mettler公司）。

1.2 試劑 甲醇、冰醋酸、庚烷磺酸鈉為色譜純；三乙胺為分析純；水為超純水。

1.3 對照品 維生素B1對照品，批號為00311，含量為95.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；核黃素磷酸鈉對照品，批號為SLBD2777V，含量（以維生素B2計）為70.0%，SIGMA-ALDRICH公司；維生素B2對照品，批號為 11021，含量為 99.2%，德國 Dr.Ehrenstorfer公司；維生素B6鹽酸鹽對照品，批號為11020，含量為100.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；煙酰胺對照品，批號為 100115-200703，含量為99.9%，中國食品藥品檢定研究院。泛酸鈣對照品，批號為100370-200301，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院。

1.4 供試品 復合維生素B注射液，規(guī)格為10 mL，含維生素B1100 mg、核黃素磷酸鈉13.7 mg（以維生素B2計10 mg）、維生素 B610 mg和煙酰胺150 mg， 批號分別為20140301、20140302、20140303，均由浙江金力制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品儲備液的制備 取維生素B1對照品約100 mg，核黃素磷酸鈉對照品約10 mg，維生素B6鹽酸鹽對照品約10 mg和煙酰胺約150 mg，精密稱定，置同一25 mL棕色量瓶中，用流動相A溶解并稀釋至刻度，作為混合對照品儲備液。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密量取混合對照品儲備液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取供試品1 mL，置25 mL棕色量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.4 空白溶液的制備 取泛酸鈣對照品50 mg，加水至100 mL，作為空白供試品；精密量取1 mL，置25 mL棕色量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，作為空白溶液。

2.2 高效液相色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相 A：三乙胺-冰醋酸-甲醇-0.015 mol／L庚烷磺酸鈉（0.2 ∶7.5 ∶75∶820），流動相 B：甲醇，梯度洗脫（表1）；檢測波長 280 nm；流速 1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量 20 μL。

表1 流動相梯度參數(shù)

2.3 線性考察 精密量取 1、2、3、5、10 mL 對照品儲備液，分別置50 mL棕色量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件分析，以對照品濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，所得線性方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表2。

圖1 核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1混合對照品溶液HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

表2 維生素B1、核黃素磷酸鈉、維生素B6、煙酰胺線性結(jié)果

2.4 專屬性考察 按2.2項色譜條件，分別對混合對照品溶液、供試品溶液、空白溶液進行分析（結(jié)果見圖1、圖2、圖3）。結(jié)果表明：空白溶液在核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1峰處無吸收峰，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1的理論板數(shù)均大于3000，核黃素磷酸鈉與煙酰胺分離度為6.6；煙酰胺與維生素B6分離度為15.7；維生素B6與維生素B1分離度為16.5。

用維生素B2對照品代替核黃素磷酸鈉對照品，配制方法同2.1.1項和2.1.2項，液相色譜圖如圖4所示。

圖3 空白溶液HPLC色譜圖

圖4 煙酰胺、維生素B2、維生素B6、維生素B1混和對照品溶液HPLC色譜圖

2.5 回收率試驗 取維生素B1、核黃素磷酸鈉、維生素B6、煙酰胺對照品適量，用空白供試品溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為添加樣品，進行加樣回收率試驗，以考察方法的準確度。每個濃度各制備3份平行樣，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

2.6 重復性試驗 取同一份供試品溶液，連續(xù)重復進樣6次，記錄峰面積，計算RSD，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素 B6、維生素 B1的 RSD分別為0.3%，0.3%，0.2%，0.2%。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗 取混合對照品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進樣，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素 B6、維生素 B1的 RSD分別為 0.5%，0.3%，0.2%，0.2%。結(jié)果表明，供試品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品測定 取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測波長的確定 取核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1對照品適量，用流動相A溶解后，在400～200 nm的波長范圍內(nèi)掃描，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素 B6、維生素 B1分別在 267、261、291、246 nm波長處有最大吸收，綜合考慮，選擇280 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 流動相中加入三乙胺，可以消除堿性物質(zhì)的拖尾現(xiàn)象，特別對于含有叔胺結(jié)構(gòu)的維生素B1更有明顯的作用。曾用流動相A作等度洗脫，維生素B1的出峰時間過長，為了縮短分析時間，選擇了梯度洗脫。

3.3 農(nóng)業(yè)部1960號公告方法的不足之處 農(nóng)業(yè)部1960號公告關(guān)于復合維生素B注射液中的維生素B1、核黃素磷酸鈉的含量測定方法采用的是重量法和紫外-可見分光光度法。重量法測定維生素B1的操作較為復雜；采用的垂熔玻璃坩堝的號數(shù)對結(jié)果影響較大；且洗滌溶劑丙酮對人體有危害。紫外-可見分光光度法測定核黃素磷酸鈉，如果有維生素B2的干擾，核黃素磷酸鈉和維生素B2均有吸收，用該方法測定的應為兩者之和。

本文對色譜條件、方法線性、專屬性、回收率和重復性等方面進行考察后，建立了高效液相色譜法。實驗結(jié)果表明，該方法操作簡便、結(jié)果準確，能有效檢測復合維生素B注射液中4種維生素的含量。

［1］中國獸藥典委員會.農(nóng)業(yè)部1960號公告.獸用國家標準（化學藥品、中藥卷）第一冊［S］.

［2］李祥勝，闞家義.復合維生素B注射液中4種維生素的含量測定［J］.安徽醫(yī)藥，2009， 13（7）： 755-756.

［3］周 杰，梁建軍，王晨光.復合維生素B注射液的含量測定［J］.河北化工， 2007，30（4）： 46-47.

［4］陳光龍，李玉蘭，劉 敏，等.高效液相色譜法同時測定復合維生素B片中4種組分的含量［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2006， 26（10）： 1256-1258.