陳 瑤，馬 倩，張 莉，王渠源，李璐璐，聶 奎

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶400715）

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白（High Mobility Group Protein，HMG）家族成員的HMGB1是一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在內(nèi)毒素的致病過程和膿毒癥中水平增高［1］。赤芍和白芍作為兩種傳統(tǒng)中藥材，赤芍具有清熱涼血，散瘀止痛功效，醫(yī)學(xué)臨床主要用于改善心血管系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等［2］；而白芍有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，平肝止痛，斂陰止汗的作用，臨床上用于抗炎、解痙、鎮(zhèn)痛、護(hù)肝等［3］。鑒于赤芍、白芍都具有一定的抗炎功效，因此，采用炎癥介質(zhì)HMGB1水平的變化來(lái)比較兩種芍藥的抗炎作用，這對(duì)治療膿毒癥等晚期炎癥的中藥研究，尤其是為含赤芍、白芍的中藥方劑的拆方研究奠定一定的藥理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 昆明種健康小鼠70只，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自重慶市中藥研究院，批號(hào)：SCXK（渝）2012-0006。小鼠飼養(yǎng)于西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院動(dòng)物房，分組后分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 赤芍、白芍購(gòu)自重慶中藥材市場(chǎng)。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。地塞米松，西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：120105。小鼠HMGB-1 ELISA試劑盒，美國(guó)Promega公司。

1.1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；ELX405TM洗板機(jī)，美國(guó)Biotek公司；Thermo酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 赤芍、白芍煎劑制備 參照楊琪偉等［4］的方法，用水提醇沉法制備赤芍、白芍煎劑，使每毫升含生藥1 g，滅菌后放入4℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 小鼠肺炎模型建立 將金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度至1×109CFU／mL，參照劉穎等［5］的方法，用乙醚將小鼠麻醉，取金黃色葡萄球菌菌液對(duì)小鼠滴鼻感染（50 μL／只），建立金黃色葡萄球菌小鼠吸入性肺炎模型。

1.2.3 試驗(yàn)分組及給藥 按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)將70只小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、肺炎模型組、赤芍處理組、白芍處理組和地塞米松處理組。每組14只。金黃色葡萄球菌小鼠吸入性肺炎模型建立1 h后按組別進(jìn)行藥物處理，空白對(duì)照組、肺炎模型組小鼠給予生理鹽水。各組均灌胃給藥，劑量均為0.01 mL／g。之后每12 h給藥一次，共6次。

1.2.4 血液樣本采集 分別于金黃色葡萄球菌感染小鼠后 18、36、48、60、72 h每組隨機(jī)選擇小鼠 5只，采集小鼠尾部血液，將采集的血液離心得血清，分裝標(biāo)記后置-20℃保存?zhèn)錂z。

1.2.5 石蠟切片制作 在72 h血液采集完成后處死小鼠，開胸摘取小鼠肺組織并投入固定液，按常規(guī)組織切片方法［6］：取材固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、HE染色、脫水透明、封片，并進(jìn)行鏡下觀察。

1.2.6 HMGB1檢測(cè) 用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中HMGB1水平，按試劑盒所附的說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺炎模型建立 感染小鼠12 h后，隨機(jī)解剖感染后的小鼠和未經(jīng)處理的小鼠各3只。經(jīng)觀察，感染小鼠肺組織均充血、腫大；未處理的小鼠肺組織均正常。金黃色葡萄球菌小鼠吸入性肺炎模型建立成功。

2.2 HMGB1含量變化 肺炎模型組小鼠與空白對(duì)照組小鼠相比，肺炎模型組小鼠HMGB1濃度值于感染小鼠后 18、36、48、60、72 h 均高于空白對(duì)照組，差異極顯著（P＜0.01）。赤芍處理組、白芍處理組、地塞米松處理組小鼠與肺炎模型組小鼠相比，赤芍處理組HMGB1濃度值于感染金黃色葡萄球菌后36 h時(shí)顯著低于肺炎模型組，于48、60、72 h時(shí)極顯著低于肺炎模型組；白芍處理組HMGB1濃度值于48、60、72 h極顯著低于肺炎模型組；地塞米松處理組HMGB1濃度值分別于48、60、72 h極顯著低于肺炎模型組。白芍處理組、赤芍處理組與地塞米松處理組相比，白芍處理組于18、60 h時(shí)顯著、極顯著低于地塞米松處理組；赤芍處理組與地塞米松處理組無(wú)顯著差異。白芍處理組與赤芍處理組相比，白芍處理組于48、60 h時(shí)極顯著低于赤芍處理組，72 h時(shí)顯著低于赤芍處理組（表1）。

2.3 肺組織病理變化 感染小鼠后72 h小鼠肺組織切片中，空白對(duì)照組肺組織正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整。肺炎模型組肺泡壁顯著增厚，肺支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔充血。白芍處理組肺組織結(jié)構(gòu)較完整，部分肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)無(wú)異物。赤芍處理組肺組織結(jié)構(gòu)較完整，僅少許肺泡腔充血。地米處理組肺組織結(jié)構(gòu)完整，部分肺泡壁增厚，少許肺泡腔充血（圖1）。

表1 赤芍、白芍煎劑對(duì)金葡菌誘導(dǎo)肺炎小鼠血清HMGB1水平影響的比較 （x ±s）

圖1 赤芍、白芍干預(yù)下72 h小鼠肺組織切片（HE 200×）

3 討論

1999 年，Wang等［7］發(fā)現(xiàn) HMGB1 可以釋放到胞外并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，為內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的重要炎癥介質(zhì)，并第一次把HMGB1認(rèn)定為一種炎癥晚期調(diào)節(jié)因子。研究已證明，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和壞死細(xì)胞在細(xì)菌、LPS、TNF-α、IL-1刺激下均可釋放HMGB1至胞外，釋放到胞外的HMGB1能再次激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，誘發(fā)IL-1、IL-8、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)釋放，而炎癥介質(zhì)又促進(jìn)HMGB1的分泌，使炎癥反應(yīng)不斷放大、加重。HMGB1在炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用，在多種感染性疾病中均扮演著重要角色。

芍藥是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，有赤芍、白芍之分；赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍，所直接使用的干燥根，而白芍為植物芍藥水煮去皮后使用的干燥根［8］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，赤芍和白芍都具有改善血液流變學(xué)狀態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體微循環(huán)，抑制血小板聚集及機(jī)體內(nèi)、外源性凝血，保護(hù)肝損傷組織等作用，中醫(yī)臨床上也多用于抗炎。之前，對(duì)赤芍、白芍抗炎的研究多集中 NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1等炎癥介質(zhì)［9-11］，卻未見有在炎癥反應(yīng)過程中是否能對(duì)炎癥介質(zhì)HMGB1水平產(chǎn)生影響的相關(guān)研究資料。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，赤芍、白芍均能顯著降低肺炎小鼠血清中HMGB1的水平，并明顯減輕肺組織損傷程度，這提示兩種藥物具有減輕炎癥反應(yīng)的作用，但相對(duì)而言，白芍的抗炎效果優(yōu)于赤芍。但在現(xiàn)代中藥藥理的試驗(yàn)研究中，多都以芍藥苷作為研究對(duì)象。項(xiàng)亞西等［12］研究表明：赤芍的芍藥苷含量達(dá)3.5%～7.98%，而白芍的芍藥苷含量?jī)H為1.86%～5.76%［12］，二者的芍藥苷含量存在有明顯差異，故單從芍藥苷這一角度無(wú)法真正表明二者的藥理學(xué)作用。赤芍、白芍都含有芍藥苷、羥基芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，苯甲酰羥基芍藥苷。但是，除赤芍的芍藥苷含量明顯高于同基源的白芍外，含量差別較大的化學(xué)成分還有芍藥內(nèi)酯苷和兒茶素等［13］，白芍的芍藥內(nèi)酯苷含量均值是赤芍樣品含量均值的6倍以上［14］，這是否說明芍藥內(nèi)酯苷是芍藥中發(fā)揮抗炎作用的主要成分之一，值得進(jìn)一步深入研究。

［1］Yang H， Wang H， Tracey K J.HMGB1 rediscovered as a cytokine［J］.Shock， 2001， 15（4）： 247-257.

［2］冀蘭鑫，黃 浩，李長(zhǎng)志，等.赤芍藥理作用的研究進(jìn)展［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33（3）：233-236.

［3］項(xiàng)亞西，張京紅.赤白芍化學(xué)成分和藥理作用的差異［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（11）：43-44.

［4］楊琪偉，楊 莉，熊愛珍，等.赤芍和白芍抗炎作用的UPLCMS代謝組學(xué)初步研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（6）：694-697.

［5］劉 穎，時(shí)宇靜，時(shí) 瀚，等.銀翹解毒軟膠囊對(duì)流感病毒感染小鼠肺炎模型肺組織病毒載量及M1蛋白表達(dá)的影響［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（6）：650 655.

［6］滕可導(dǎo).彩圖家畜組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.

［7］Wang H，Bloom O，Zhang M，et al.HMG-B1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice［J］.Science， 1999， 285（5425）：248-251.

［8］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典二○一○年版［S］.

［9］魏 曉.赤芍煎劑治療重癥胰腺炎及對(duì)大鼠體內(nèi)炎癥介質(zhì)的影響［D］.第二軍醫(yī)大學(xué)，2007.

［10］朱慧民，牟華明.赤芍對(duì)球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜單核細(xì)胞趨化蛋白-1基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008， 15（3）： 138-141.

［11］李志軍，劉 雁，梅永君，等.白芍總苷治療強(qiáng)直性脊柱炎的療效及其機(jī)制探討［J］.中藥藥理與臨床，2009，25（3）：68-70.

［12］項(xiàng)亞西，張京紅.赤白芍化學(xué)成分和藥理作用的差異［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（11）：43-44.

［13］周紅濤，駱亦奇，胡世林，等.赤芍與白芍的化學(xué)成分含量比較研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志， 2003， 38（9）： 654-656.

［14］吳金雄.白芍、赤芍化學(xué)成分與活血功效的比較研究［D］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012.