張崇威，班付國，宋志超，陳 薔，吳寧鵬

（河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008）

隨著畜牧業(yè)發(fā)展，用于預(yù)防和治療禽畜疾病的獸藥品種也不斷增加，人藥獸用以及獸用藥物殘留超標(biāo)的現(xiàn)象也越來越多［1］。阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素、頭孢匹林、頭孢拉定屬于人用藥物，尚未批準(zhǔn)在獸醫(yī)臨床上使用，但在實(shí)際的畜產(chǎn)品藥物殘留檢驗(yàn)中卻時(shí)有發(fā)現(xiàn)。頭孢氨芐、頭孢噻肟作為常用獸藥在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中被濫用導(dǎo)致殘留量超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重。造成這種現(xiàn)象的原因，主要是由于一些不法養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用，從而造成在禽畜產(chǎn)品中的殘留超標(biāo)。為打擊和防范違法使用和濫用這些藥物，有必要建立這7種藥物殘留的同步檢測(cè)技術(shù)。目前，對(duì)于此7種藥物的單個(gè)或多個(gè)檢測(cè)方法也分別有報(bào)道，已報(bào)道的有13種林可胺類及大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測(cè)［2］，以及13種β-內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測(cè)［3］，但是同時(shí)測(cè)定該7種藥物殘留的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。本研究建立了7種藥物殘留的快速、準(zhǔn)確、同步檢測(cè)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquit UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters公司）；3K-30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；R215 Professional旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 Buchi公司）；IKAMS3.Basic圓周振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；ALC-2100.2電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水；阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素、頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 分別精密稱取7種標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg，置于10 mL量瓶中，阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解并稀釋成約1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定用50%乙腈溶液溶解，并稀釋成濃度約1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。然后用50%乙腈溶液逐步稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫 30 ℃；流動(dòng)相 A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；進(jìn)樣量 5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè) MRM；離子源溫度150℃；霧化溫度500 ℃；霧化器流速1000 L／h；錐孔氣流速150 L／h；毛細(xì)管電壓2.9 kV；定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 7種藥物定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

1.4.3 樣品前處理 稱取2±0.02 g勻質(zhì)樣品，置于50 mL 離心管內(nèi)，加乙腈溶液（15+2，V／V）10 mL，渦旋混勻，中速振蕩10 min，8000 r／min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL離心管內(nèi)。重復(fù)提取一次，合并提取液。向提取液中加正己烷8 mL，渦旋混合 5 min，5000 r／min 離心 5 min，吸取下層溶液10 mL于雞心瓶中，50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2.00 mL 20%乙腈溶液溶解殘?jiān)?，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 精密吸取200 μg／L的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL，分別加入雞心瓶中，并向其中加入 10 mL空白基質(zhì)，從“50℃下快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干”開始，按照樣品同步處理。 從而配制成 2、5、10、20、50、100 μg／L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依次上機(jī)，以各藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表 3），可以看出 7種藥物在 2～100 μg／L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上。

表3 7種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 檢測(cè)限和定量限 向空白豬肉、雞肉、雞蛋試樣中添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)處理上機(jī)。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S／N＞3為檢測(cè)限，S／N＞10為定量限，檢測(cè)到阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的檢測(cè)限為 0.5 μg／kg，定量限為 1 μg／kg，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定的檢測(cè)限為2 μg／kg，定量限為 4 μg／kg。

2.3 方法的靈敏度和準(zhǔn)確度 分別在豬肉、雞肉、雞蛋組織中添加 4、8、20 μg／kg的 7 種藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，連續(xù)測(cè)定3批，其平均回收率、變異系數(shù)如表4。阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的回收率在80%～100%之間，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢拉定的回收率在70%～90%之間，批內(nèi)批間的變異系數(shù)均小于20%。圖1為空白雞肉中添加8 μg／kg的各藥物特征離子質(zhì)量色譜圖。

表4 7種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

圖1 空白雞肉中添加8 μg／kg的7種藥物特征離子質(zhì)量色譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化 由于頭孢類藥物結(jié)構(gòu)中含有較強(qiáng)酸性的羧基，在以硅膠為固定相中易出現(xiàn)拖尾和峰形異常的現(xiàn)象，因此選用高純硅膠為基體并經(jīng)端基封閉的反相色譜柱作為色譜分析柱［2］。已報(bào)道的流動(dòng)相有甲酸銨水溶液和乙腈［4］，考慮到流動(dòng)相中有機(jī)溶劑含量、離子強(qiáng)度以及pH值大小，都會(huì)對(duì)阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的離子化強(qiáng)度、溶解性以及在色譜柱上的分離產(chǎn)生影響［5］。所以，實(shí)驗(yàn)選用乙腈和0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，并進(jìn)行梯度洗脫，得到了分離度以及對(duì)稱因子均較好的峰形。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 首先采用以100 ng／mL的各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI+的模式下進(jìn)行母離子掃描，確定準(zhǔn)確的準(zhǔn)分子離子，然后測(cè)出相應(yīng)2個(gè)子離子，并優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使其相應(yīng)的響應(yīng)值達(dá)到最大。

3.3 提取液的優(yōu)化 阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素屬弱堿性藥物，易溶于酸性水溶液和極性較大的有機(jī)溶劑，這類藥物的提取和凈化主要依據(jù)其弱堿性、脂溶性和酸不穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化［5］，已報(bào)道提取溶劑有 Tris 緩沖液［6］、偏磷酸-甲醇溶液［7］、甲醇和乙腈等，而頭孢類藥物由于本身結(jié)構(gòu)帶有羧基基團(tuán)，所以在堿性環(huán)境中水溶性較好，已報(bào)道的提取液有磷酸鹽緩沖鹽（pH 8.5）［8］、0.5%的冰醋酸水溶液［4，9］，乙腈等，本實(shí)驗(yàn)綜合考慮了阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素以及頭孢類藥物的溶解性之間的差異和相近之處，并考察乙腈 ∶水＝95∶5（V／V）、乙腈 ∶水＝90 ∶10（V／V）、乙腈 ∶水＝80 ∶20（V／V）、乙腈 ∶水＝15∶2（V／V）作為提取液，發(fā)現(xiàn)提取液為乙腈 ∶水＝90∶10（V／V）或者乙腈比例增加時(shí)，頭孢類的提取效率非常低，而當(dāng)提取液為乙腈∶水＝80∶20（V／V）或者水比例再提高時(shí)，阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的提取率就比較低，最終確定乙腈 ∶水＝15∶2（V／V）溶液作為提取液。

3.4 凈化條件的優(yōu)化 阿奇霉素、克林霉素、羅紅霉素的凈化方法常用液液萃取、固相萃取等方法，已報(bào)道的固相萃取柱有 C18、HLB、SCX 柱等［2］。頭孢類藥物的凈化方法有固相萃取，已報(bào)道的固相萃取柱有 Oasis HLB［8］、XAD-2 固相萃取等［9］。 可見，7種藥物提取液的凈化柱可以采用HLB柱，但經(jīng)HLB柱凈化后頭孢類藥物的回收率較低，且過柱時(shí)容易堵塞，本實(shí)驗(yàn)考慮到樣品基質(zhì)特性，采用液液萃取的方法用正己烷除去脂肪等極性較小的雜質(zhì)，省去固相萃取的步驟，使得前處理簡(jiǎn)潔經(jīng)濟(jì)，同時(shí)也得到了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本研究通過摸索，得出乙腈與水適宜比例的溶液用于同時(shí)提取7種藥物，同時(shí)優(yōu)化液相色譜條件和質(zhì)譜條件，從而建立了豬肉、雞肉、雞蛋中7種藥物同時(shí)檢測(cè)的UPLC-MS／MS方法，并且其靈敏度和準(zhǔn)確度滿足藥物殘留的分析。

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