張國(guó)梁，吳 江，關(guān) 鍵，關(guān) 宏，李德超，王心彧

（1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

口腔頜面部惡性腫瘤以癌最為常見，其中又以鱗狀細(xì)胞癌最多見，約占80%以上［1］。舌癌是最常見的口腔癌，容易發(fā)生早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高［1，2］。目前舌癌的治療方式是以手術(shù)治療為主，以及術(shù)前、術(shù)后的化療來提高療效。但是傳統(tǒng)的化療通常存在著腫瘤細(xì)胞耐藥、化療藥物毒副作用等不利因素，因此從動(dòng)植物、礦物質(zhì)、海洋生物等天然物質(zhì)中尋找高效低毒的治療惡性腫瘤的藥物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。乳桿菌屬于益生菌［3］，通過發(fā)酵糖類、蛋白質(zhì)、脂類和氨基酸等，可以得到乳酸、乙酸、細(xì)菌素、過氧化氫、胞外多糖、胞外多聚糖、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等代謝產(chǎn)物物質(zhì)，乳桿菌及其代謝產(chǎn)物具有抗感染、抗氧化、抗齲齒和抗腫瘤功能，并與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化的調(diào)控有關(guān)［4］。實(shí)驗(yàn)中乳桿菌A-2的代謝產(chǎn)物1（LSPM1）和代謝產(chǎn)物2（LSPM2））均為復(fù)雜的混合物，里面包含氨基酸、蛋白質(zhì)和游離的金屬離子等成分。本實(shí)驗(yàn)主要目的是檢測(cè)該混合物對(duì)人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞的抑制及誘導(dǎo)凋亡情況，混合物的抗癌有效成分仍需進(jìn)一步研究，以便為篩選新的抗腫瘤生物活性劑提供更有利的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Annexin V-FITC／PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱，倒置熒光顯微鏡（X-50，Nikon），流式細(xì)胞分析儀（FACSCalibur型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

乳桿菌A-2（Lactobacillus sp A-2）（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院提供），人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供），DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基，胎牛血清（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），MTT 試劑盒，吖啶橙（AO）染料（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），MRS（DeMan Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基，復(fù)原乳清培養(yǎng)基（乳清粉50g／L，碳酸鈣20g／L，pH6.0～6.5，121℃滅菌15min），復(fù)原乳清菊糖培養(yǎng)基（乳清粉50g／L，碳酸鈣20g／L，菊糖10g／L，pH6.0～6.5，121℃滅菌15min）。

1.3 乳桿菌A-2菌懸液的制備

乳桿菌A-2放入已添加MRS的15mL離心管中，放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24h，以上步驟重復(fù)3次，72h后取出，再離心，取等體積的無菌生理鹽水（含10mM CaCl2）沖洗乳桿菌A-2沉淀2次，再離心，棄上清液，然后制備菌懸液，備用。

1.4 乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物的制備

將上述菌懸液分別接種于復(fù)原乳清培養(yǎng)基和復(fù)原乳清菊糖培養(yǎng)基中，菌液濃度為1OD／mL，100r／min振蕩，放置于40℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48h。然后取出菌液，離心，取上清液，經(jīng)過真空冷凍干燥分別得到凍干粉（乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物L(fēng)SPM1和LSPM2），-20℃保存，備用。

1.5 CAL-27細(xì)胞培養(yǎng)

CAL-27 細(xì)胞復(fù)蘇后，加入DMEM 培養(yǎng)基，放置于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，12h，觀察細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)、80%～90%融合時(shí)，利用0.05%胰蛋白酶消化傳代。

1.6 MTT 法測(cè)定LSPM1和LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

將1.0×104／mL 的CAL-27細(xì)胞分別接種到96孔板中，每孔0.1mL，實(shí)驗(yàn)組是濃度分別為1.875mg／mL、3.75mg／mL、7.5mg／mL、15mg／mL、30mg／mL 的LSPM1；陽性對(duì)照組是濃度1μg／mL的紫杉醇；空白對(duì)照組是只加培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，于終止培養(yǎng)前2h加入5mg／mL的MTT 溶液20μL，培養(yǎng)2h，離心，棄上清液，加入150μL 的DMSO，震蕩5～10min，直到完全溶解。測(cè)定570nm 的吸光度（A570nm）值，公式：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A570nm值／空白對(duì)照組A570nm值）×100%。利用上述方法再測(cè)定LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.7 熒光顯微鏡觀察CAL-27細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

將2.4×105／mL CAL-27細(xì)胞懸液接種于放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)中24h后，分別加入濃度為36mg／mL的LSPM1和36mg／mL的LSPM2，空白對(duì)照組只添入培養(yǎng)基，再置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中16h，取出蓋玻片，固定5min，吖啶橙染色5～10min，再用PBS沖洗后，在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

制備1.5×106／mLCAL-27細(xì)胞懸液，取2mL 接種于培養(yǎng)皿中。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱12h，分別加入濃度為36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2，繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后用0.05%的胰蛋白酶消化，PBS沖洗2次，500μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞（1.0～1.5×106／mL）加入5μL Annexinv-FITC，輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育15min，再加入5μLPI，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育5min，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 瓊脂糖凝膠電泳法分析

將3×106／mL 的CAL-27細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培 養(yǎng) 箱24h，經(jīng)36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2分別作用后，定時(shí)收集細(xì)胞，PBS沖洗，加入100μL 細(xì)胞裂解液，置于4℃下10min，離心后吸取上清液，并加入2μL 濃度為20mg／mL 的RNase A，置于37℃下60min，再加入2μL 濃度為20mg／mL 的proteinase K，置于37℃下60min，然后加入NaCl-異丙醇，置于-20℃下，靜止過夜。然后離心（7，200g）15min后，去除NaCl-異丙醇，加入TE后沉淀溶解，經(jīng)過1%的瓊脂凝膠電泳（80V），1h后，紫外燈下檢測(cè)并攝像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行處理。用獨(dú)立樣本方差分析各組間的差異，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 LSPM1和LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：1.875mg／mL、7.5mg／mL、15mg／mL、30mg／mL LSPM1對(duì)CAL-27細(xì)胞作用48h后，抑制率分別達(dá)到（45.40±9.51）%、（43.35±5.19）%、（65.63±5.45）%和（79.14±8.09）%，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。1.875mg／mL、3.75 mg／mL、7.5mg／mL、15mg／mL和30mg／mL LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞作用48h后，抑制率分別達(dá)到）21.94±2.68）%、（39.31±4.63）%、（47.81±14.24）%、（69.66±5.38）%和（85.29±2.95）%，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。LSPM1和LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞的作用無顯著性差異（見圖1）。以上結(jié)果表明：乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物對(duì)CAL-27細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率具有濃度依賴性。

圖1 LSPM1和LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖的影響

2.2 熒光顯微鏡觀察CAL-27細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變

利用經(jīng)吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組中CAL-27細(xì)胞核為均一的綠色熒光，細(xì)胞貼壁良好；然而經(jīng)過36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2 處 理16h 后，CAL-27細(xì)胞染色質(zhì)濃縮成塊狀、邊緣化、核膜裂解、出現(xiàn)凋亡小體（見圖2）。

圖2 CAL-27細(xì)胞形態(tài)特征

2.3 LSPM1和LSPM2誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析

經(jīng)FCM 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，濃度為36mg／mL 的LSPM1作用于CAL-27 細(xì)胞12h 后，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為37.20%和10.09%；濃度為36mg／mL 的LSPM2 作用于CAL-27 細(xì)胞12h 后，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為11.22%和69.48%；而對(duì)照組的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為2.23%和4.27%?？梢?，實(shí)驗(yàn)組結(jié)果明顯高于對(duì)照組（見圖3）。

圖3 LSPM1和LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響

2.4 瓊脂糖凝膠電泳法分析細(xì)胞凋亡

瓊脂糖凝膠電泳顯示，36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2對(duì)CAL-27細(xì)胞作用不同的時(shí)間后，DNA 出現(xiàn)片段化，在250～750bp之間出現(xiàn)明顯的“階梯狀”DNA 條帶，說明DNA 在核小體連接處被切斷，CAL-27 細(xì)胞發(fā)生凋亡。由此證明了乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞凋亡。

圖4 LSPM1和LSPM2誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞凋亡電泳圖

3 討論

益生菌是口腔微生物菌群的重要組成菌，益生菌（尤其是乳桿菌）可通過抑制致病菌生長(zhǎng)和繁殖、與致病菌競(jìng)爭(zhēng)口腔黏膜表面的黏附位點(diǎn)等，保護(hù)口腔健康，預(yù)防口腔軟硬組織疾病。肖越紅等［5］研究證明乳桿菌DM9811代謝產(chǎn)物脂肪酸組分對(duì)口腔白假絲酵母菌有明顯的抑殺作用；對(duì)口腔鏈球菌有促進(jìn)作用，可能有調(diào)整口腔菌群平衡的作用。曲虹等［6］研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌DM9811（Lactobacillus DM9811）代謝產(chǎn)物可以改善固定正畸治療患者的改良菌斑指數(shù)（MPLI）和唾液pH，抑制變形鏈球菌（streptococcusmutans）生長(zhǎng)和維持正畸治療患者的口腔內(nèi)菌群平衡。

肽聚糖（peptidoglycan，PG）是乳酸桿菌細(xì)胞壁的主要組成成分［7］。研究顯示肽聚糖成分在提高肌體免疫監(jiān)視功能方面可能起重要作用。溫曉慶等［8］以肝癌H22細(xì)胞移植瘤KM 小鼠為模型，研究干酪乳桿菌（Lactobacillus case）細(xì)胞壁肽聚糖的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的m RNA 表達(dá)和BLC-2基因的蛋白表達(dá)平均光密度值均明顯低于對(duì)照組，且抑瘤率37.21%。

乳桿菌的代謝產(chǎn)物乳桿菌胞外多糖（exopoly-saccharides，EPS）具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能。Choi等［9］研究證實(shí)嗜酸乳桿菌EPS具有抗癌活性且可誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。張鈞等［10］研究表明乳桿菌EPS在體外有一定的促進(jìn)對(duì)人大腸癌LS174T 細(xì)胞的凋亡的作用。翟碩莉［11］報(bào)道了乳酸菌胞外多糖抗腫瘤的作用機(jī)制之一是乳酸菌能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。王江等［12］證明彎曲乳桿菌T79-3黏附能力最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，排除作用方式抑制金黃色葡萄球菌黏附He La細(xì)胞作用效果較好，提示乳桿菌T79-3有可能作為益生菌防治婦女泌尿生殖道感染。

乳清蛋白主要用于治療糖尿病和高血壓，在抗腫瘤方面的研究較少［13，14］。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，BLG，58%）和α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，ALA，13%）組成。β-乳球蛋白是硫氨基酸主要來源，具有免疫調(diào)節(jié)作用，α-乳白蛋白具有預(yù)防癌癥的功能［15］。而且，乳清蛋白中的生物活性肽和氨基酸可以通過蛋白酶降解或微生物發(fā)酵而釋放出來。本實(shí)驗(yàn)中，通過乳桿菌A-2去降解乳清蛋白和乳清蛋白與菊糖組成的混合物，分別得到代謝產(chǎn)物L(fēng)SPM1和LSPM2，已經(jīng)證實(shí)LSPM1和LSPM2中含有一些多肽、氨基酸、短鏈脂肪酸，乳酸、醋酸、丁酸等化學(xué)物質(zhì)。利用人舌鱗癌細(xì)胞系CAL-27 體外培養(yǎng)模型初步評(píng)價(jià)了LSPM1和LSPM2的抗癌活性，為益生菌代謝產(chǎn)物在治療口腔癌方面提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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