胡玉華，顏 凌，劉子酉，席淑華

（1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，福建 廈門(mén) 361000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

地方性氟中毒是我國(guó)發(fā)病最廣、人口最多、病情最重的地方病之一，有病區(qū)縣1380 個(gè)，受威脅人口達(dá)1.25 億［1］。氟中毒除了引起氟斑牙和氟骨癥外，一些氟中毒患者常伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為頭痛、頭暈、記憶力減退等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙癥狀。氟離子可以通過(guò)血腦屏障在腦組織中蓄積［2］，氟的反應(yīng)活性極強(qiáng)，可直接攻擊氧，干擾氧代謝，影響抗氧化酶的活性，導(dǎo)致活性氧（ROS）、自由基增多。活性氧與自由基已被認(rèn)為是氟引起腦損傷的基礎(chǔ)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中的免疫細(xì)胞，一些內(nèi)外因素均可使其激活，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)NADPH 氧化酶（還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸）產(chǎn)生大量的ROS。NADPH氧化酶在小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)，是催化生成超氧陰離子自由基（O2·-）的主要酶類(lèi)。本研究以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2細(xì)胞）為受試對(duì)象，通過(guò)加入NADPH 氧化酶抑制劑后測(cè)定氟處理BV-2細(xì)胞ROS產(chǎn)生情況，了解NADPH 氧化酶在氟作用下小膠質(zhì)細(xì)胞ROS產(chǎn)生中的作用，為氟致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)公司）；150 型二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（荷蘭Heraeus公司）；倒置顯微鏡（Nikon公司）；流式細(xì)胞儀（FACScan）。氟化鈉（NaF，上海生工生物工程有限公司）；MTT（美國(guó)Hyclone公司）；NADPH 氧化酶抑制劑API（Santa Cruz Biotechnology 公司）；硝基酪氨酸（NT）試劑盒（北京安必維抗體技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1×105U／L 青、鏈霉素），5% CO237℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)進(jìn)行1：3傳代，本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用2d換液，3d傳代一次的方法。

1.3 細(xì)胞增殖活力的測(cè)定

用0.25%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×104個(gè)／孔的密度接種于96孔板中，每孔體積200μL。將96孔板放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后，加入濃度為0、1、5、10、25、50、100mg／L 的氟化鈉，分別在染毒6、12、48h，加入MTT 溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。細(xì)胞活力用MTT 的還原率表示。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

將細(xì)胞以4×104個(gè)／mL 的密度接種于6 孔板，于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后，加入濃度為0，1，5，10，25，50，100mg／L 的氟化鈉，染毒6，12h和24h后加入熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)NADPH 氧化酶抑制劑處理的細(xì)胞，在細(xì)胞生長(zhǎng)約60%時(shí)，加入100μm NADPH 氧化酶抑制劑API，2h之后加入濃度50mg／L NaF 處理24h，加入熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm，以DCF的平均熒光強(qiáng)度表示ROS生成量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0for Windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞增殖活力的影響

BV-2細(xì)胞染毒6h后，100mg／L NaF 染毒組細(xì)胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但在1和5mg／L NaF處理組，細(xì)胞增殖活力出現(xiàn)一個(gè)顯著升高現(xiàn)象，之后，隨染氟劑量的增加細(xì)胞增殖活力顯著降低；染毒12h后，10、100mg／L NaF染毒組細(xì)胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；染毒24h后，1、5、10、100mg／L NaF染毒組細(xì)胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞增殖活力的影響（±s，n=3）

表1 氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞增殖活力的影響（±s，n=3）

注：＊與對(duì)照組相比，P＜0.05；＃ 與對(duì)照組相比，P＜0.01。

2.2 氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞中ROS含量的影響

BV-2細(xì)胞染毒6h后，5mg／L NaF以上染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；染毒12h后，10mg／L NaF以上染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；染毒24h后，50、100mg／L NaF染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響（±s，n=3）

表2 氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響（±s，n=3）

注：＊與對(duì)照組比較，P＜0.05，＃ 與對(duì)照組比較，P＜0.01。

2.3 NADPH 氧化酶對(duì)氟化鈉暴露的BV-2細(xì)胞ROS水平的影響

我們先前的研究已發(fā)現(xiàn)氟能引起小膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平增加［3］，因此，為檢測(cè)氟引起的ROS水平增高是否由NADPH 氧化酶引起，我們加入NADPH 氧化酶抑制劑API與氟共同處理小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)API能夠顯著降低NaF 誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量，見(jiàn)表3。

表3 NADPH 氧化酶抑制劑對(duì)氟處理的BV-2細(xì)胞ROS含量的影響（±s，n=3）

表3 NADPH 氧化酶抑制劑對(duì)氟處理的BV-2細(xì)胞ROS含量的影響（±s，n=3）

注：a 與0mg／L NaF染毒組比較，P＜0.01；b 與50mg／L NaF染毒組比較，P＜0.01。API：NADPH 氧化酶抑制劑。

3 討論

由于神經(jīng)系統(tǒng)耗氧率高，腦膜富含易氧化的多不飽和脂肪酸，腦組織中的抗氧化酶活性相對(duì)比其他組織低，對(duì)氧介導(dǎo)的損傷非常敏感。目前多數(shù)研究認(rèn)為，氟誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是氟引起腦損傷的基礎(chǔ)。作為神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在正常狀態(tài)下處于靜息狀態(tài)，當(dāng)中樞神經(jīng)微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)可激活為活化狀態(tài)［4］，抵御外來(lái)抗原的侵襲，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。然而，過(guò)度的活化可釋放過(guò)多的炎性因子和ROS等，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［5，6］。NADPH 氧化酶是介導(dǎo)免疫細(xì)胞細(xì)胞外超氧化物產(chǎn)生的主要酶，在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。NADPH 氧化酶能夠催化氧分子生成超氧陰離子自由基（O2·-）［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，氟處理組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯著高于對(duì)照組，并呈顯著的劑量-反應(yīng)關(guān)系。由此可以推測(cè)，氟可誘導(dǎo)ROS水平增高，引起氧化應(yīng)激。API，一種廣泛使用的NADPH 氧化酶抑制劑，顯著降低了氟引起的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。說(shuō)明NADPH 氧化酶參與了氟誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果表明氟可降低小膠質(zhì)細(xì)胞活力，引起小膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷，NADPH 氧化酶在氟誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生中起一定作用。

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