黨慧敏，劉艷巧*，吳曉玲，劉潤(rùn)俠，安 鵬

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者，E-mail:liuyanqiao@sohu.com)

應(yīng)激(stress)是指機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境刺激時(shí)所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)，其對(duì)于生殖能夠產(chǎn)生較為不利的影響，通常都與妊娠失敗密切相關(guān)且還會(huì)影響子代的健康［1，2］，以往對(duì)聲波應(yīng)激模型研究表明，圍著床期接受應(yīng)激后會(huì)使流產(chǎn)率增加［3］，而其可能的機(jī)制與母胎界面的炎性細(xì)胞募集等有關(guān)［4］;胚胎是一種半同種異體移植物，但大多數(shù)都不被母體免疫系統(tǒng)所排斥，而是維持至分娩，即母胎免疫耐受［5］，而補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)于適應(yīng)性免疫具有調(diào)節(jié)作用［6］，活化的補(bǔ)體成分如C3a、C5a等可趨化招募炎性細(xì)胞，炎性細(xì)胞經(jīng)可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-t)途徑如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)下降導(dǎo)致胎盤發(fā)育不足，發(fā)生胚胎損傷，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)及宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth restriction，IUGR)的發(fā)生［7］。CBA/J(雌)×DBA/2J(雄)小鼠為國(guó)際上公認(rèn)的自發(fā)性流產(chǎn)經(jīng)典模型，與人類RSA臨床表現(xiàn)類似，本文以其為研究對(duì)象，明確補(bǔ)體激活在應(yīng)激后自發(fā)性流產(chǎn)孕鼠早期流產(chǎn)及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇8周齡未經(jīng)產(chǎn)雌性CBA/J小鼠80只，雄性DBA/2J小鼠30只及BALB/c小鼠10只，體質(zhì)量18-22 g，均購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。將雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J及BALB/c小鼠按2∶1于前晚6∶00合籠，次日晨8∶00用鑷子檢查陰栓，可見陰栓者即為妊娠0.5 d，雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J小鼠合籠后成功受孕57只，受孕率為95%，將成功受孕的自然流產(chǎn)模型CBA/J(雌)×DBA/2J(雄)孕鼠編號(hào)后按隨機(jī)化原則分為模型組、低應(yīng)激組及高應(yīng)激組，每組各19只。雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠合籠后成功受孕20只，設(shè)為正常對(duì)照組，模型組小鼠平均周齡(7.32± 0.82)周，平均體質(zhì)量(19.89±1.38)g。高應(yīng)激組平均周齡(7.58±0.69)周，平均體質(zhì)量(20.30±1.23)g。低應(yīng)激組平均周齡(7.42±0.77)周，平均體質(zhì)量(20.05±1.32)g。對(duì)照組平均周齡(7.55±0.60)周，平均體質(zhì)量(20.28±1.28)g。各組小鼠年齡及體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 干預(yù)方法

參照Blois等［8］聲波應(yīng)激模型方法，低應(yīng)激組孕鼠于妊娠5.5 d給予持續(xù)24 h聲頻為460 Hz，1 s/次，間隔14 s(由 Mathworks Matlab R2009a軟件控制)，分貝強(qiáng)度為88 dB(由優(yōu)利德電子(上海)有限公司生產(chǎn)UT351分貝測(cè)量?jī)x測(cè)定)的聲波刺激;高應(yīng)激組孕鼠于妊娠5.5 d給予持續(xù)24 h聲頻為460 Hz，5 s/次，間隔 10 s，分貝強(qiáng)度為 88 dB 的聲波刺激;對(duì)照組及模型組孕鼠均不接受任何聲波刺激。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

將各組孕鼠分為兩批取材，首先于妊娠7.5 d對(duì)各組孕鼠各14只行眶下靜脈取血2 ml，檢測(cè)其血清C3a及VEGF、sFlt-1水平，同時(shí)留取各組孕鼠胎盤蛻膜組織測(cè)定VEGF蛋白表達(dá)水平;最后于妊娠13.5 d處死對(duì)照組孕鼠6只及模型組、低、高應(yīng)激組孕鼠各5只，分別記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)，稱重胚胎質(zhì)量，并計(jì)算胚胎吸收率。

1.3.1 血清C3a及VEGF、sFlt-1檢測(cè) 將各組孕鼠2 ml靜脈血1 500 r/min離心5 min后取上清，采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)所采集血清標(biāo)本的C3a、VEGF、sFlt-1水平，操作按試劑盒(購(gòu)自福州藍(lán)圖生物科技有限公司)的說明書進(jìn)行;根據(jù)吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線換算小鼠血清C3a、VEGF及sFlt-1質(zhì)量濃度。

1.3.2 蛻膜組織VEGF蛋白表達(dá)測(cè)定 將各組孕鼠胎盤蛻膜組織固定于0.01 mg/ml甲醛中，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm連續(xù)切片后，常規(guī)脫蠟，梯度酒精中浸泡，滴加3%的雙氧水15 min以滅活內(nèi)源性酶;熱修復(fù)抗原;滴加兔抗VEGF多克隆抗體(一抗，滴度1∶100，Abcam公司生產(chǎn))，4℃孵育過夜;滴加有辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(二抗，北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn))，37℃孵育45 min，DBA顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，顯色后脫水，透明，封片。光鏡下觀察，VEGF表達(dá)陽性為棕黃色顆粒。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其他步驟相同。選取同批染色切片，每張切片在光鏡下隨機(jī)取5個(gè)不同視野，以切片染色的背景作對(duì)照，用OLYMPUS CX31病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)定陽性信號(hào)的積分光密度(integral optical density，IOD)值，以此反映組織切片中相應(yīng)陽性物質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 胚胎吸收率及重量測(cè)定 將各組孕鼠于麻醉處死后記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)，稱重胚胎質(zhì)量，并計(jì)算胚胎吸收率［胚胎吸收率=死胎數(shù)/(活胎數(shù)+死胎數(shù))×100%］。

死胎判斷標(biāo)準(zhǔn)［9］:丟失胚胎為體積明顯縮小，或失去正常胚胎形狀，胎兒胎盤單位顏色暗紅，母胎界面有出血水腫。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胚胎吸收率、胚胎重量的比較

將各組孕鼠處死后，觀察并記錄其子宮、胚胎、胎盤、羊膜囊的情況。正常對(duì)照組(圖1A，見第1001頁)可見正常胚胎粗大如串珠狀，胚胎呈淡紅色，胚胎體積及形態(tài)正常，母胎界面無出血及水腫;應(yīng)激組(圖1B、1C，見第1001頁)可見羊膜囊較小，胎兒胎盤單位顏色暗紅，母胎界面有明顯出血或可見部分子宮呈竹節(jié)樣改變，胚胎呈黑褐色，僅見到胚胎著床點(diǎn)，胚胎已完全或部分消失。

圖1 丟失胚胎的判定(妊娠13.5 d)Figure 1 Macroscopic evaluation of fetal loss(gestational 13.5 d)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織的VEGF表達(dá)水平(×400)Figure 2 Expression of VEGF in decidual tissue by immunohistochemistry(×400)

我們進(jìn)一步分析各組胚胎吸收率和胚胎重量，結(jié)果顯示:相比對(duì)照組，模型組胚胎吸收率明顯升高;低、高應(yīng)激組與模型組分別相比較，其胚胎吸收率均明顯升高;且高應(yīng)激組與低應(yīng)激組相比，胚胎吸收率明顯增高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05，見表1)。各組胚胎重量相比較，模型組顯著低于對(duì)照組;模型組胚胎重量值高于低、高應(yīng)激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高應(yīng)激組與低應(yīng)激組相比，其胚胎重量明顯下降，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

表1 各組胚胎吸收率及胚胎重量的比較Table 1 Comparison of embryo absorption rate and embryo weight among four groups

2.2 各組小鼠血清C3a、VEGF和sFlt-1水平的比較

各組血清C3a及sFlt-1水平相比較，模型組均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2);各應(yīng)激組與模型組相比，其血清C3a及sFlt-1水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而高應(yīng)激組血清C3a及sFlt-1水平均明顯高于低應(yīng)激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，各組血清VEGF水平相比，模型組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，應(yīng)激組其血清VEGF水平相比模型組均明顯下降(P＜0.05)，高應(yīng)激組血清VEGF水平相比低應(yīng)激組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組血清C3a、VEGF及sFlt－1水平的比較(±s)Table 2 Comparison of serum C3a，VEGF and sFlt－1 levels among four groups(±s)

表2 各組血清C3a、VEGF及sFlt－1水平的比較(±s)Table 2 Comparison of serum C3a，VEGF and sFlt－1 levels among four groups(±s)

與對(duì)照組比較，ΔP＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與低應(yīng)激組比較，*P＜0.05

高應(yīng)激組 201.16±103.2523.55±7.172 797.00±396.57

2.3 各組小鼠蛻膜VEGF蛋白表達(dá)水平的比較

在各組小鼠蛻膜中，VEGF主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中(圖2，見第1002頁)，模型組小鼠蛻膜VEGF陽性染色明顯低于正常對(duì)照組，組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，應(yīng)激后自然流產(chǎn)小鼠蛻膜VEGF積分光密度值相比模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中高應(yīng)激組小鼠蛻膜VEGF表達(dá)水平與低應(yīng)激組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表3)。

表3 各組蛻膜VEGF表達(dá)水平的比較(±s)Table 3 Comparison of decidual VEGF expression levels among four groups(±s)

表3 各組蛻膜VEGF表達(dá)水平的比較(±s)Table 3 Comparison of decidual VEGF expression levels among four groups(±s)

與對(duì)照組比較，ΔP＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與低應(yīng)激組比較，*P＜0.05

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3 討論

固有免疫系統(tǒng)為抵御外源性微生物侵害機(jī)體的第一道防線，補(bǔ)體是固有免疫的重要組成成員。補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)經(jīng)典途徑、旁路途徑、甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑所激活，形成C3轉(zhuǎn)化酶，將C3分解為C3a和C3b，C3a脫落進(jìn)入體液，而C3b分別與C4b2b和C3bBb結(jié)合組成C5轉(zhuǎn)化酶C4b3b2b和C3b3bBb，進(jìn)而形成攻膜復(fù)合物(MAC)［10］?；罨疌5a和 C3a是強(qiáng)烈的過敏性毒素，可招募激活炎性細(xì)胞，導(dǎo)致或增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CBA/J(雌)×DBA/2J(雄)自然流產(chǎn)模型小鼠胚胎吸收率明顯較正常對(duì)照組高，胎盤及存活胚胎的重量顯著低于正常組;胚胎殘骸、胎盤及蛻膜的單核細(xì)胞有大量C3沉著，炎性細(xì)胞的浸入。補(bǔ)體抑制劑Crry-Ig或B因子敲除或抗B因子抗體處理后均可顯著降低胚胎吸收率、胚胎重量增長(zhǎng)，減少C3的沉著和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，與正常組無差異，表明RSA及IUGR發(fā)生與補(bǔ)體異常激活密切相關(guān)［11，12］。本研究結(jié)果顯示，自發(fā)流產(chǎn)模型組孕鼠胚胎吸收率相比正常對(duì)照組明顯升高，胚胎重量低于對(duì)照組，同時(shí)血清C3a水平較對(duì)照組明顯升高，亦證明自然流產(chǎn)及IUGR的發(fā)病與補(bǔ)體異常激活關(guān)系密切。

近年來研究顯示，補(bǔ)體異常激活可通過sFlt-1途徑導(dǎo)致RSA的發(fā)生。胎盤正常發(fā)育依賴于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)及相應(yīng)的受體，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體異常激活型RSA可能與血管生成因子紊亂有關(guān)，sFlt-1具有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Ⅰ樣結(jié)合VEGF的能力，但無生物學(xué)功能，具有強(qiáng)烈的抗血管生成作用［13］。自然流產(chǎn)模型小鼠血清游離VEGF水平明顯低于正常組，不足以滿足妊娠的需求，而流產(chǎn)組sFlt-1較對(duì)照組明顯升高;流產(chǎn)組經(jīng)補(bǔ)體抑制劑Crry-Ig處理，可阻止sFlt-1升高，游離VEGF水平與對(duì)照組相當(dāng)，妊娠得以維持，且胚胎重量相比自然流產(chǎn)明顯升高，表明sFlt-1升高是補(bǔ)體異常激活的結(jié)果，是RSA及IUGR的重要機(jī)制。本研究結(jié)果表明，模型組相比正常組血清sFlt-1升高，血清VEGF水平下降同時(shí)胎盤蛻膜VEGF表達(dá)減少，影響胚胎原始血管形成、胚胎發(fā)育、胎盤形成等過程，從而導(dǎo)致RSA及IUGR的發(fā)生。

研究表明，軀體或心理的應(yīng)激都會(huì)使神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)受到影響，而這些系統(tǒng)的平衡正是妊娠維持所必需的，在通常狀態(tài)下，細(xì)胞應(yīng)激或組織受損，細(xì)胞里一般就會(huì)釋放一些分子并且與固有免疫細(xì)胞表面上的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRRs)相結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)［14］，通過研究接受應(yīng)激后的小鼠模型表明，其成熟的子宮樹突狀細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)，子宮引流淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞下降，并且分泌炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ的Th1細(xì)胞克隆擴(kuò)增增長(zhǎng)，從而嚴(yán)重影響了胚胎耐受［15］，其中精神應(yīng)激不但能夠?qū)е虏辉卸夷軐?dǎo)致流產(chǎn)，有研究表明聲波應(yīng)激能夠?qū)е氯焉镌缙谕N異體胚胎的丟失，可能與其導(dǎo)致Th1/Th2比值升高有關(guān)［16］，其能夠減少高和低胚胎丟失模型鼠中大血管分布密度，在高胚胎丟失模型中，聲波應(yīng)激可使表達(dá)VCAM-1的血管分布顯著增加［17］。通過本研究結(jié)果顯示，接受聲波應(yīng)激后自然流產(chǎn)孕鼠相比較模型組，胚胎吸收率明顯升高，存活胚胎重量進(jìn)一步下降，同時(shí)血清C3a及sFlt-1水平異常增高，且升高水平與其接受應(yīng)激的強(qiáng)度呈正比，血清VEGF水平及蛻膜VEGF表達(dá)顯著下降，分析其導(dǎo)致高胚胎流失率并加劇IUGR發(fā)生的作用機(jī)制可能與應(yīng)激導(dǎo)致補(bǔ)體過度活化產(chǎn)生過多的C3a趨化激活中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞，激活的中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞經(jīng)sFlt途徑導(dǎo)致胎盤蛻膜VEGF表達(dá)減少，胎盤血管形成不足，血管重塑障礙有關(guān)，且病情程度與應(yīng)激程度呈正相關(guān)。

總之，本研究證實(shí)補(bǔ)體異常激活在應(yīng)激致RSA早期流產(chǎn)、IUGR中均發(fā)揮重要作用，不同程度的應(yīng)激刺激導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)經(jīng)典途徑或旁路途徑異常激活，且活化的程度與其受應(yīng)激的強(qiáng)度成正比，異?；罨难a(bǔ)體成分趨化招募炎性細(xì)胞，炎性細(xì)胞經(jīng)sFlt途徑導(dǎo)致胎盤發(fā)育不足導(dǎo)致胚胎損傷，導(dǎo)致早期流產(chǎn)及IUGR發(fā)生，而應(yīng)激導(dǎo)致補(bǔ)體過度活化等具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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