魏 敏，羅 仁，李璟怡，柳志偉，鄭雪花

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350122;2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院;*通訊作者，E-mail:minwei99@163.com)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是重要的死亡原因。近年來，DN已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要病因［1］，糖尿病腎病嚴(yán)重威脅人類健康。早期診斷、早期治療對糖尿病腎病預(yù)后有重要的影響，因此尋找靈敏度特異度高的分子標(biāo)志物，以達(dá)到早期診斷的目的具有重要的意義。蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展適用于尋找疾病的分子標(biāo)記物研究［2，3］。本研究以糖尿病腎病(DN)大鼠模型為研究對象，應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，初步篩選糖尿病腎病的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為糖尿病腎病的發(fā)生機制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用SPF級Wistar雄性大鼠16只，體重200－280 g，鼠齡為3個月左右，南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心供應(yīng)，合格證:SCXK(粵)2011－0015。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳儀(ProteanⅡxi cell)及其配件均為Bio-Rad公司配套儀器;圖像分析軟件為PD-Quest;質(zhì)譜儀用德國布魯克(Bruker Dalton)Autoflex speed MALDI－TOF/TOF質(zhì)譜儀。

1.1.3 試劑 干膠條 drystrip(24 cm，pH 4－7)購自Bio-Rad公司;IPG Buffer(pH 4－7)、水化盤、覆蓋油購自GE公司;尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、3－［(3－膽酰胺丙基)－二乙銨］－丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris堿)、丙烯酰胺(Arc)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(AP)、碘代乙酰胺(IAA)均為Sigma公司產(chǎn)品;硫脲為Fluka公司產(chǎn)品;硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、甲醛、硝酸銀、乙醇、冰醋酸、醋酸鈉、甘氨酸均為天津大茂化學(xué)試劑廠試劑，分析純。所有緩沖液均用Milli-Q水配制。藥物STA、血漿去高豐度蛋白試劑盒(ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，造模大鼠8只按65 mg/kg腹腔內(nèi)一次性注射STZ。STZ臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.5)配制，10 min內(nèi)注射完，同時其余8只大鼠設(shè)為正常對照組。

1.2.2 血漿采集 處死DN模型組和正常對照組大鼠時腹主動脈取血，置 4℃ 3 000×g離心10 min，吸取上層血漿，EP管每100μl分裝后，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙向電泳 取100μg蛋白樣品與上樣緩沖液(4%CHAPS，65 mmol/L DTT，1%IPG buffer，7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，1×BPB溴酚藍(lán))充分混合，總體積460μl，選用24 cm pH 4－7干膠條drystrip，參考文獻(xiàn)［4］和儀器操作手冊進(jìn)行等電聚焦、SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.4 凝膠染色 電泳結(jié)束后，用塑料尺子將玻璃板翹起，輕輕取下膠條，并切角標(biāo)記，放入染色盤中進(jìn)行硝酸銀染色。

1.2.5 圖像掃描與分析 掃描儀獲取染色后凝膠圖像，用PD-Quest軟件進(jìn)行分析，選取表達(dá)量相差2倍以上為差異表達(dá)范圍。

1.2.6 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫檢索 對選定的差異蛋白點進(jìn)行膠內(nèi)酶切及質(zhì)譜鑒定。采用德國布魯克(Bruker Dalton)Autoflex speedTMMALDI－TOF/TOF質(zhì)譜分析，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da，掃描質(zhì)量范圍為700－3 200 Da，收集信號，胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用flexAnalysis(BrukerDalton)軟件過濾基線峰、識別信號峰。利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 銀染2-DE圖譜及差異分析

正常對照組、模型組銀染2-DE圖譜見圖1。將正常對照組、模型組凝膠圖像用PD-Quest軟件進(jìn)行差異分析。與正常對照組相比，模型組血漿蛋白質(zhì)銀染雙向凝膠電泳圖譜中高表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點54個，低表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點19個。

2.2 質(zhì)譜鑒定

結(jié)合軟件分析及手工篩選，對2-DE獲得的差異表達(dá)蛋白點選定16個挖點進(jìn)行膠內(nèi)酶切，再用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定分析，經(jīng)BioTools軟件分析蛋白數(shù)據(jù)庫NCBInr檢索，成功鑒定出8種蛋白質(zhì)(見表1)。血清對氧磷酶肽指紋圖譜見圖2、C反應(yīng)蛋白肽指紋圖譜見圖3，橫坐標(biāo)表示肽段的質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)表示肽段強度。

3 討論

圖1 銀染雙向電泳圖譜Figure 1 Silver stained 2-DE map of proteins in normal control group and model group

表1 質(zhì)譜鑒定的差異表達(dá)蛋白Table 1 Differentially expressed proteins identified by mass spectrometry

圖2 血清對氧磷酶肽指紋圖譜Figure 2 Peptide mass fingerprinting of serum paraoxonase

圖3 C反應(yīng)蛋白肽指紋圖譜Figure 3 Peptide mass fingerprinting of C-reactive protein

糖尿病腎病的發(fā)病機制十分復(fù)雜，有多種因素共同作用［5］，包括腎臟血流動力學(xué)的改變、血糖過高導(dǎo)致代謝紊亂、高血壓及血管活性物質(zhì)代謝異常、細(xì)胞因子的作用、遺傳及不良生活習(xí)慣的影響等。糖尿病腎病目前還很難做到早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷，因此，找到與DN相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物已成為糖尿病腎病研究的熱點問題之一。

蛋白組學(xué)由澳大利亞科學(xué)家Witzmann等［6］于1995年首次提出，是整合蛋白質(zhì)提取、分離、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等技術(shù)，對組織和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及功能進(jìn)行高通量篩選和分析的一門學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在DN的發(fā)病機制研究中起著重要的作用，蛋白分離后的質(zhì)譜技術(shù)主要用于蛋白質(zhì)的鑒定。其基本原理是將樣品分子或離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)量與電荷比(m/z)的差異來分離并確定分子量。本項目研究應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)成功分離蛋白，找出差異蛋白點，然后應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)MALDI－TOF/TOF對差異蛋白點進(jìn)行鑒定。最終初步鑒定8種蛋白質(zhì)可能與糖尿病腎病相關(guān)，分別是血清對氧磷酶(serum paraoxonase)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein)、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin)、Igκ鏈C區(qū)(Ig kappa chain C region)、纖維蛋白原α鏈(fibrinogen alpha chain)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor)、纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain)、結(jié)合珠蛋白(haptoglobin)。

血清對氧磷酶、C反應(yīng)蛋白可能與糖尿病腎病的發(fā)病機制密切相關(guān)，有研究［7］表明血清對氧磷酶(serum paraoxonase，PON)是存在于高密度脂蛋白分子中的一種酶，可降低氧化脂質(zhì)水平，部分水解脂質(zhì)過氧化物，減少氧化型脂質(zhì)積聚，具有抗氧化的作用，對2型糖尿病微血管病變的發(fā)生有重要的影響。C反應(yīng)蛋白是機體非特異性炎癥中的最敏感指標(biāo)，其導(dǎo)致DN的發(fā)病機制可能為慢性炎癥造成腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的損害等多種途徑使腎臟損傷;炎癥反應(yīng)可引發(fā)機體的氧化應(yīng)激，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物如MDA，導(dǎo)致腎組織細(xì)胞膜的生理狀態(tài)被破壞，血管通透性增加，造成腎損害［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)血清對氧磷酶、C反應(yīng)蛋白等對糖尿病腎病有較好的診斷價值。

在后續(xù)的實驗中，對鑒定出的差異蛋白功能深入研究，擴大樣本量，將有助于闡明這些蛋白質(zhì)在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，進(jìn)一步明確糖尿病腎病早期診斷的分子標(biāo)志物，為早期治療及改善預(yù)后奠定基礎(chǔ)。

［1］Collins AJ，Kasiske B，Herzog C，etal.Excerpts from the United States Renal Data System 2004 annual data report:Atlas of endstage renal disease in the United States［J］.Am J Kidney Dis，2005，45(1):A5－A7.

［2］Deng L，Jia HL，Liu CW，etal.Analysis of differentially expressed proteins involved in hand，foot and mouth disease and normal sera［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(6):E18－196.

［3］Shi Y，Deng X，Zhan Q，etal.A Prospective proteomicbased study for identifying potential biomarkers for the diagnosis of cholangio carcinoma［J］.J Gastrointest Surg，2013，20(6):678－680.

［4］Gorg A，Obermaier C，Boguth G，etal.The current state of two－dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients［J］.E-lectrophoresis，2000，21(6):1037－1053.

［5］王海燕.腎臟病學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:414－421.

［6］Witzmann F，Clack J，F(xiàn)ultz C，etal.Two-dimensional electrophoretic mapping of hepatic and renel stress proteins［J］.Electrophroesis，1995，16(3):451－459.

［7］Pinizzollo M，Castillo E，F(xiàn)iaux M，etal.Paraoxonase 2 polymorphism are associated with diabetic nephropathy in typeⅡdiabetes［J］.Diabetologia，2001，1(44):104－107.

［8］Kashihara N，Hatuna Y，Kondeti VK，etal.Oxidative stress in diabetic nephropathy［J］.Curr Med Chem，2010，17(34):4256－4269.