隋雷鳴，趙煥英，鞏云霞，付文卓，王俐勇*

(1首都醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京 100069;2山東省莒縣人民醫(yī)院急診科;*通訊作者，E-mail:wly0410@163.com)

目前，基因芯片在科研領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，這些應(yīng)用主要包括基因表達(dá)檢測(cè)、突變檢測(cè)、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測(cè)序等方面。獲取高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行包括基因芯片、第二代高通量測(cè)序、數(shù)字化PCR、cDNA文庫等很多分子生物學(xué)研究的必要前提［1-3］?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)對(duì)于RNA的質(zhì)量要求較高，這對(duì)RNA提取在完整性和純度方面有了更高的要求。由于RNA非常不穩(wěn)定，易被降解，RNA酶無處不在，獲得高純度且完整的RNA并不容易［4，5］。RNA的降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留，會(huì)產(chǎn)生許多偽陰性的結(jié)果，芯片結(jié)果的可靠性大大降低，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。?-9］。

盡管目前已經(jīng)建立起許多RNA分離提取方法，并開發(fā)出若干商品化RNA分離提取試劑盒［10-18］，但對(duì)于像基因芯片和高通量測(cè)序等高質(zhì)量要求的樣本，其應(yīng)用效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證［6，8］。為了達(dá)到提取高質(zhì)量RNA提取效果的需求，本研究擬以小鼠腦組織為材料，以TissueLyserⅡ高通量組織研磨器為組織破碎勻漿工具，比較目前市面上較常見RNA提取試劑:天根生化科技有限公司組織總RNA提取試劑盒、Ambion公司組織總RNA提取試劑盒和Invitrogen公司的Trizol試劑提取的總RNA和反轉(zhuǎn)錄后cRNA質(zhì)量的差異，并對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，建立適合于基因芯片實(shí)驗(yàn)的組織高質(zhì)量RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性 BALB/c小鼠(8-10周，SPF級(jí)，首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)。

1.1.2 主要試劑 Trizol(Invitrogen公司);試劑盒Ⅰ:RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司);試劑盒Ⅱ:PureLink?RNA Mini Kit(Ambion公司);試劑盒Ⅲ:Illumina?TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品取材 小鼠分為3組提取總 RNA，每組5只。常規(guī)消毒后，快速斷頭取腦，預(yù)冷PBS簡單沖洗后，剪成約20 mg小塊，放入液氮速凍后，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 總RNA 的提取方法

(1)Trizol法、試劑盒Ⅰ、試劑盒Ⅱ:每樣品加Trizol或裂解液，并放入研磨珠，TissueLyserⅡ高通量組織研磨器高速震蕩研磨，然后分別完全按照Trizol試劑、試劑盒Ⅰ、試劑盒Ⅱ操作說明進(jìn)行。

(2)試劑盒Ⅰ改良方法:吸附柱CR3置于室溫放置由2 min延長至5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1或漂洗液RW，由直接離心改為室溫放置30 s后再離心;最后向吸附膜的中間部位懸空滴加60μl RNase-Free ddH2O由常溫改為提前60℃預(yù)熱，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min;洗脫次數(shù)由一次改為二次，收集RNA溶液。其余步驟不變。

(3)試劑盒Ⅱ改良方法:吸附柱中加入漂洗液Ⅰ或漂洗液Ⅱ后，由直接離心改為室溫放置30 s后再離心;最后由常溫改為提取60℃預(yù)熱的60μl RNase-Free ddH2O洗脫，室溫放置放置時(shí)間由1 min延長至2 min，12 000×g離心2 min，洗脫次數(shù)由一次改為二次，收集RNA溶液。其余步驟不變。

(4)試劑盒Ⅲ:每樣品取500 ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈cDNA;第二條鏈cDNA的合成;cDNA純化;體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記的cRNA;cRNA純化。流程完全按照試劑盒說明書進(jìn)行，步驟繁多，在此不詳述。

1.2.3 RNA、cRNA 產(chǎn)量、純度和完整性測(cè)定RNA電泳分析:完整性RNA可用普通瓊脂糖凝膠電泳，然后以紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。電泳條件:1%普通瓊脂糖凝膠，0.5×TBE電泳緩沖液，電壓100 V，30 min。

Nanodrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA和cRNA濃度和純度:吸取待測(cè)量樣本1.5μl放在測(cè)量基座的表面，測(cè)定其在230、260和280 nm處的紫外吸光值。測(cè)得濃度值乘以RNA洗脫體積得到總RNA的產(chǎn)量。以 A260/A280、A260/A230比值做純度分析，A260/A280≥1.9，A260/A230≥1.5 被認(rèn)為純度較好。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，以單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA電泳分析結(jié)果

對(duì)采用試劑盒Ⅰ的方法提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，28S、18S和5S電泳條帶很弱，改良后得到的RNA電泳條帶明顯出現(xiàn)(見圖1);采用試劑盒Ⅱ的方法提取的總RNA電泳后28S、18S和5S條帶較清晰，改良后條帶亮度有明顯增加，28S和18S比值約為2，提示RNA完整性好;采用Trizol試劑法提取的RNA電泳后28S、18S和5S條帶亮度最高，28S和18S比值在1-2之間，但伴有輕微拖尾現(xiàn)象。

圖1 小鼠腦組織總RNA普通瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from mouse brain

2.2 RNA、cRNA產(chǎn)量和純度測(cè)定結(jié)果

不同方法提取的總RNA產(chǎn)量和純度見表1。從表1可以看出，Trizol試劑法提取的總RNA產(chǎn)量高于兩種試劑盒提取的總RNA產(chǎn)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);試劑盒Ⅰ、Ⅱ經(jīng)改良后，RNA產(chǎn)量均有明顯增加，與改良前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);試劑盒Ⅱ提取的總RNA產(chǎn)量顯著高于試劑盒Ⅰ提取的總RNA產(chǎn)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);試劑盒Ⅰ、Ⅱ改良后 A260/A280、A260/A230的比值與改良前相比沒有顯著性差異;試劑盒Ⅱ的A260/A280、A260/A230的比值明顯高于Trizol法和試劑盒Ⅰ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

不同方法提取的總RNA均取500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cRNA濃度見表2。以試劑盒Ⅱ法得到的cRNA濃度最高，與Trizol法和試劑盒Ⅰ相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。試劑盒Ⅱ改良前后得到的cRNA濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同方法提取小鼠腦組織總RNA的產(chǎn)量和純度(±s，n=5)Table 1 RNA yield and purity by different RNA extraction methods(±s，n=5)

表1 不同方法提取小鼠腦組織總RNA的產(chǎn)量和純度(±s，n=5)Table 1 RNA yield and purity by different RNA extraction methods(±s，n=5)

與試劑盒改良前相比，＊P＜0.01;與試劑盒提取法相比，#P＜0.01;與試劑盒Ⅰ相比，▲P＜0.01;與 Trizol法，△P＜0.01

Trizol法 56.58±9.13#1.82±0.74 1.568±0.33

表2 不同方法提取的小鼠腦組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cRNA的濃度(±s，n=5)Table 2 Concentration of cRNA by total RNA reverse transcription of different RNA extraction methods(±s，n=5)

表2 不同方法提取的小鼠腦組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cRNA的濃度(±s，n=5)Table 2 Concentration of cRNA by total RNA reverse transcription of different RNA extraction methods(±s，n=5)

與試劑盒Ⅰ相比，*P＜0.01;與 Trizol法相比，#P＜0.01

Trizol法330.20±48.66

3 討論

獲取高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行基因芯片實(shí)驗(yàn)的必要前提［1-3］?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)主要是以放大與信使RNA(mRNA)完全配對(duì)的互補(bǔ)RNA(cRNA)，再進(jìn)行后續(xù)的芯片雜交實(shí)驗(yàn)。如果RNA存在嚴(yán)重的降解，那么許多mRNA并不能被忠實(shí)地放大，因此會(huì)產(chǎn)生許多偽陰性的結(jié)果，芯片結(jié)果的可靠性大大降低［6-10］。RNA中蛋白、酚類或胍鹽等物質(zhì)的殘留，則可能干擾反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的過程。

RNA質(zhì)量控制一般通過樣品吸光值比率和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估，A260/A280的比值用于估計(jì)核酸的純度，是否存在蛋白和苯酚污染;A260/A230比值用于估計(jì)脫鹽程度［11-18］?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)對(duì)樣品的要求為:總 RNA濃度≥100 ng/μl，RNA總量≥2 μg，A260/A280≥1.9，A260/A230≥1.5，RNA 電泳 28S 與18S的比值接近2。按以上標(biāo)準(zhǔn)，Trizol法提取的RNA產(chǎn)量最高，A260/A280、A260/A230的比值基本滿足基因芯片實(shí)驗(yàn)要求，但A260/A280、A260/A230的比值低于Ambion試劑盒提取法，且RNA電泳后28S、18S條帶伴有輕微拖尾現(xiàn)象。天根試劑盒和Ambion試劑盒在方法改良后均取得了較理想的提取結(jié)果，RNA總量有明顯提高，但天根試劑盒提取的RNA A260/A280，A260/A230比值偏低，這種純度的 RNA可以滿足普通RT-PCR試驗(yàn)需求，但無法保障基因芯片實(shí)驗(yàn)要求;而Ambion試劑盒提取的RNA A260/A280，A260/A230比值滿足基因芯片實(shí)驗(yàn)要求;說明Ambion試劑盒改良后提取的RNA質(zhì)量最佳。

基因芯片實(shí)驗(yàn)主要是以放大與mRNA完全配對(duì)的cRNA，再進(jìn)行與芯片的雜交反應(yīng)，雜交濃度為150 ng/μl。本實(shí)驗(yàn)中，取等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的cRNA，以Ambion試劑盒提取的cRNA濃度最高，與Trizol法和天根試劑盒相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步說明Ambion試劑盒提取的RNA質(zhì)量優(yōu)于Trizol法和天根試劑盒。

綜上所述，Ambion試劑盒法提取的小鼠腦組織總RNA的產(chǎn)量和純度均能滿足芯片實(shí)驗(yàn)要求。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化改良后得到的總RNA產(chǎn)量有顯著提高，而且對(duì)RNA的純度和完整性沒有影響。

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