許剛柱，張 鵬，李 文，趙 慧，吳 濤，張俊鋒，王茂德

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710077;2西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者，E-mail:xgz917@126.com)

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率位居顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤首位，呈惡性侵襲性發(fā)展，預(yù)后常較差。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)基因家族成員之一，CEACAM1在多種腫瘤中可以影響其增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等［1－3］。然而關(guān)于CEACAM1在膠質(zhì)瘤中的作用還不十分清楚。本研究以CEACAM1基因作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對CEACAM1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞后觀察其對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SHG44細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自于Invitrogen公司。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液與胎牛血清(FBS)購自于HyClone公司，兔抗人CEACAM1單克隆抗體購自Epitomics公司。兔抗人β-catenin單克隆抗體和兔抗人Cyclin D1單克隆抗體北京中杉金橋公司。兔抗人GAPDH多克隆抗體購自賽諾博公司，CCK-8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)二抗購自陜西先鋒生物科技有限公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒購自Becton Dickinson(BD)公司，BCA蛋白定量試劑盒與ECL化學(xué)發(fā)光液購自PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的CEACAM1基因序列(NM_001712.4)和RNAi的設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)3段siRNA。①目標(biāo)干擾位點(diǎn)1674－1696，設(shè)計(jì)正義鏈:5’－CAGCCACAGAAAUAAUUUATT－3’，反義鏈:5’－UAAAUUAUUUCUGUGGCUGTT－3’，命名為CEACAM1-siRNA1;②目標(biāo)干擾位點(diǎn)2889－2911，設(shè)計(jì)正義鏈:5’－CUACCAUUCUAUUCCAUGUTT－3’，反 義 鏈:5’－ACAUGGAAUAGAAUGGUAGTT－3’，命名為 CEACAM1-siRNA2;③目標(biāo)干擾位點(diǎn) 3130－3152，設(shè) 計(jì) 正 義 鏈:5’－CAGCCUCUGAAAUUUAUCUTT－3’，反義鏈:5’－AGAUAAAUUUCAGAGGCUGTT－3’，命名為 CEACAM1-siRNA3。siRNA序列經(jīng)BLAST(http://nlm.nih.gov/BLAST/)檢索證實(shí)與CEACAM1以外的其他基因無同源性。另外設(shè)計(jì)一段不針對任何基因的siRNA序列作為陰性對照，正義鏈:5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’，反義鏈:5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。以上序列均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將SHG44細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，5%CO2、37℃、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將對數(shù)生長的SHG44細(xì)胞培養(yǎng)到96孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70% 時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，初期實(shí)驗(yàn)分為5組:正常對照組(細(xì)胞未經(jīng)任何處理)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)，CEACAM1-siRNA1組，CEACAM1-siRNA2組和 CEACAM1-siRNA3組。用LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑，按siRNA轉(zhuǎn)染說明書操作，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 Westernblot法檢測 RNA 干擾對 CEACAM1及Wnt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 于轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞48 h后，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的總蛋白，用BCA法測定蛋白含量，總蛋白在10%凝膠中電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液(5%脫脂奶粉和0.05%Tween-20 TBS緩沖液)中4℃過夜;分別加入一抗CEACAM1單克隆抗體(1∶1 000)、β-catenin單克隆抗體(1∶1 000)和 Cyclin D1單克隆抗體(1∶1 000)及 GAPDH 多克隆抗體(1∶1 000)，室溫1 h，TBS-T洗膜3次，結(jié)合HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h，TBS-T洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測，計(jì)算機(jī)掃描圖像，測出各條帶面積灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 于轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中分別孵育 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，然后向每孔加入10μl CCK-8溶液，再在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測每組吸光度OD值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后用0.25%胰酶消化并收集各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞1次，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入預(yù)冷的70%乙醇1 ml固定4℃環(huán)境下過夜。染色前用PBS洗1次，加入150μl RNaseA重懸細(xì)胞，37℃消化30 min。加100μl PI(50μg/ml)染液染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算細(xì)胞周期的分布率。

1.2.6 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后48 h胰酶消化各組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸后稀釋成1×106個(gè)/ml，將100μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上層，下室中加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出上室，用濕棉簽輕輕擦拭掉未穿過膜的細(xì)胞，4% 多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色。用蒸餾水沖凈浮色，顯微鏡(×200)下計(jì)數(shù)穿過濾膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 用50 mg/L Matrigel處理Transwell小室的聚碳酸濾膜(濾膜孔徑為8 μm)小室底部膜的上室面，并在室溫下過夜干燥。轉(zhuǎn)染后48 h胰酶消化各組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，吸取100μl細(xì)胞懸液加至Transwell小室上室，下室加入600μl完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去濾膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，行結(jié)晶紫染色，顯微鏡(×200)下計(jì)數(shù)穿過濾膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后CEACAM1蛋白在SHG44細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后Western blot結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組CEACAM1蛋白水平低于正常對照組和陰性對照組，其中CEACAM1-siRNA3轉(zhuǎn)染后CEACAM1降低最為明顯，分別測定各條帶灰度值，計(jì)算出CEACAM1-siRNA1、CEACAM1-siRNA2 和 CEACAM1-siRNA3細(xì)胞中CEACAM1蛋白表達(dá)抑制率分別為31.7%，41.2%和73.6%，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見圖1)。根據(jù)Western blot結(jié)果，選擇CEACAM1-siRNA3沉默CEACAM1基因的表達(dá)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為3組:正常對照組(細(xì)胞未經(jīng)任何處理)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)、CEACAM1-siRNA組(轉(zhuǎn)染CEACAM1-siRNA3)。

2.2 siRNA對SHG44細(xì)胞增殖的影響

CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染48 h后CEACAM1-siRNA組與正常對照組及陰性對照組比較，細(xì)胞生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期時(shí)相分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常對照組和陰性對照組細(xì)胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占比例接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CEACAM1-siRNA組的G0/G1期細(xì)胞比例增多、S期細(xì)胞比例減少，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)，表明CEACAM1-siRNA誘導(dǎo)SHG44細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。

圖1 siRNA對SHG44細(xì)胞CEACAM1蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of siRNA on the CEACAM1 protein expression in SHG44 cells

表1 siRNA下調(diào)CEACAM1對SHG44細(xì)胞增殖的影響(±s，%)Table 1 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on proliferation of SHG44 cells(±s，%)

表1 siRNA下調(diào)CEACAM1對SHG44細(xì)胞增殖的影響(±s，%)Table 1 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on proliferation of SHG44 cells(±s，%)

與正常對照組比較，*P＜0.05

CEACAM1-siRNA 組 0.226±0.023 0.227±0.022 0.253±0.029 0.408±0.015* 0.612±0.017*

表2 siRNA下調(diào)CEACAM1對SHG44細(xì)胞周期的影響(±s，%)Table 2 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on cell cycle of SHG44 cells(±s，%)

表2 siRNA下調(diào)CEACAM1對SHG44細(xì)胞周期的影響(±s，%)Table 2 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on cell cycle of SHG44 cells(±s，%)

與正常對照組比較，*P＜0.05

CEACAM1-siRNA 52.6±1.835.1±1.612.4±0.8

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常對照組、陰性對照組以及 CEACAM1-siRNA組SHG44細(xì)胞遷移數(shù)目分別為70.32±3.36、68.28±5.64 和 32.30±4.28，CEACAM1-siRNA組遷移平均細(xì)胞數(shù)顯著低于正常對照組、陰性對照組(P＜0.05);而兩組對照組之間，差異無顯著性(P=0.221)，提示siRNA沉默CEACAM1基因表達(dá)后可以顯著抑制SHG44細(xì)胞遷移能力。

2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常對照組、陰性對照組以及CEACAM1-siRNA組SHG44細(xì)胞穿膜數(shù)目分別為:25.36±4.38、23.19±3.62 和 12.72±3.57，CEACAM1-siRNA 組穿膜細(xì)胞數(shù)較正常對照和陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)，其相對侵襲力僅為空白對照組的50.3%，說明 CEACAM1表達(dá)下調(diào)可以抑制SHG44細(xì)胞的體外侵襲能力。

2.6 siRNA對Wnt信號通路相關(guān)蛋白β-catenin和Cyclin D1表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，CEACAM1-siRNA組中β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平與正常對照組比較明顯下降，正常對照組和陰性對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

圖2 siRNA對SHG44細(xì)胞β-catenin和Cyclin D1表達(dá)的影響Figure 2 Effect of siRNA transfection onβ-catenin and Cyclin D1 protein expression in SHG44 cells

3 討論

膠質(zhì)瘤多呈侵襲性生長，不易完全切除，且多數(shù)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放療及化療不敏感，臨床治療效果較差，所以探索新的治療方法具有極其重要的臨床意義。CEACAM1的生物學(xué)功能十分復(fù)雜，在不同腫瘤中的作用也不盡相同，甚至呈現(xiàn)相反的作用［1－3］:CEACAM1在多種腫瘤如前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和膀胱癌中的表達(dá)普遍下降，故被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子［4－7］;但在舌癌、肺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤和惡性黑色素瘤中CEACAM1表達(dá)增加，有可能促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展和遷移［8－12］。

目前國內(nèi)外有關(guān)膠質(zhì)瘤中CEACAM1的研究相對較少，在SHG44細(xì)胞株中的表達(dá)及其與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的關(guān)系也未見報(bào)道。本課題組前期研究［11］通過免疫組織化學(xué)的方法，檢測了人腦膠質(zhì)瘤中 CEACAM1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中CEACAM1可能是一個(gè)促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的因素。因此，本研究旨在利用siRNA技術(shù)進(jìn)一步探討CEACAM1對膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果表明沉默CEACAM1表達(dá)可能是治療腦膠質(zhì)瘤一種新的有效途徑。

本實(shí)驗(yàn)通過體外化學(xué)合成針對CEACAM1基因設(shè)計(jì)的siRNA序列，轉(zhuǎn)染后48 h與正常對照組及陰性對照組相比，干擾組CEACAM1的表達(dá)明顯下降，提示所設(shè)計(jì)siRNA序列可以特異性地降低CEACAM1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)干擾后SHG44細(xì)胞生長顯著慢于正常對照組和陰性對照組，提示在膠質(zhì)瘤中CEACAM1可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，這與舌癌、肺癌、胰腺癌和惡性黑色素瘤中報(bào)道的CEACAM1 效應(yīng)一致［8－10，12］。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):CEACAM1的表達(dá)抑制使細(xì)胞周期停滯在G0/G1，導(dǎo)致SHG44細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞增加，S期和G2/M期細(xì)胞減少。β-catenin、Cyclin D1是 Wnt信號通路的重要組成成分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化及調(diào)控細(xì)胞周期等重要作用［13］。Western blot結(jié)果顯示 CEACAM1-siRNA組中 β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平明顯下降(圖2)，進(jìn)一步說明干擾CEACAM1基因表達(dá)可以延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。作為β-catenin的目標(biāo)蛋白之一，Cyclin D1在SHG44和BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)入G1期的早期發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用［14］，在腫瘤細(xì)胞中，由于β-catenin的表達(dá)增加，降解減少，從而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積，激活Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Cyclin D1蛋白含量上升，從而促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期之間的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程和增殖［15］。有研究表明，CEACAM1作為一個(gè)細(xì)胞活動(dòng)中的重要調(diào)節(jié)因子，可以通過Wnt信號通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和血管發(fā)生［16］，而膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展也與Wnt信號系統(tǒng)激活密切相關(guān)［17］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明 CEACAM1-siRNA抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用可能是通過下調(diào)Wnt信號通路中的靶基因β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因，而腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲則是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的必要條件。在肺癌［18］、胃癌［19］中 CEACAM1 的高表達(dá)使得癌細(xì)胞更易于轉(zhuǎn)移;在肝母細(xì)胞瘤患者［20］及鼠類畸胎癌細(xì)胞株(F9DR)［21］中CEACAM1表達(dá)的缺失則可能促進(jìn)了轉(zhuǎn)移;在甲狀腺癌中CEACAM1表現(xiàn)為限制腫瘤生長，但卻增加轉(zhuǎn)移侵襲的機(jī)會(huì)［22］。以前認(rèn)為結(jié)腸癌中CEACAM1缺失有利于腫瘤發(fā)生［23］，但最近的研究［24］卻認(rèn)為結(jié)腸直腸癌中CEACAM1過表達(dá)與臨床分期密切相關(guān)，CEACAM1-L表達(dá)與結(jié)直腸癌病人的腫瘤轉(zhuǎn)移和較短的生存明顯相關(guān)，且通過劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲小室實(shí)驗(yàn)表明CEACAM1再次表達(dá)，說明CEACAM1-L促進(jìn)了遷移和侵襲。以上各項(xiàng)研究說明不同腫瘤中CEACAM1的角色并不一樣。本研究通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察SHG44細(xì)胞的遷移和侵襲能力的改變，結(jié)果顯示，與正常對照組和陰性對照組比較，干擾組SHG44細(xì)胞遷移及穿膜的數(shù)目降低，說明CEACAM1-siRNA能顯著抑制SHG44細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似于最近在結(jié)腸癌細(xì)胞中的研究結(jié)論:CEACAM1可以借助調(diào)節(jié)N－鈣黏蛋白的表達(dá)抑制結(jié)腸癌的細(xì)胞與基質(zhì)黏附，促進(jìn)細(xì)胞遷移［25］。在 SHG44細(xì)胞中下調(diào)CEACAM1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

總之，本研究通過siRNA技術(shù)下調(diào)SHG44細(xì)胞中CEACAM1的表達(dá)，觀察到SHG44細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，體外遷移和侵襲能力下降，結(jié)果提示CEACAM1有望成為一個(gè)膠質(zhì)瘤的分子治療靶點(diǎn)。

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