鄭 瑾，馬力天，任秦有，劉 毅，王彥達(dá)，蔣宏祥，荊云濤，楊明會*

(1解放軍總醫(yī)院中醫(yī)院，北京100085;2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中醫(yī)科暨中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科;3第四軍醫(yī)大學(xué);#共同第一作者;*通訊作者，E-mail:Ymh9651@sina.com)

奈達(dá)鉑［1］、β－欖香烯［2－4］對宮頸癌 HeLa 細(xì)胞都有抑制作用，但是宮頸癌對化療的敏感性差，并且大劑量使用化療藥物會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。β－欖香烯擁有較好的抗腫瘤作用，并且可以改善化療后出現(xiàn)的骨髓抑制［5］。本實驗采用體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞為靶細(xì)胞，用MTT法觀察不同劑量欖香烯、奈達(dá)鉑單獨和聯(lián)合作用不同時間對HeLa細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測其對HeLa細(xì)胞凋亡的情況。旨在為進(jìn)一步研究新的化療方案和欖香烯的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

β－欖香烯乳(大連華立金藥業(yè)有限公司)，MTT(購自晶彩生物有限公司)，奈達(dá)鉑(齊魯制藥有限公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermofisher)、四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。HeLa細(xì)胞來自第四軍醫(yī)大學(xué)放射醫(yī)學(xué)教研室，流式細(xì)胞儀(美國Bection Dickinson公司)。

1.2 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

用含 10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1%L－谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞孵箱中，每天換液一次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為80%－90%時，以胰酶37℃消化2－3 min傳代。

1.3 藥物濃度的選擇

按公式 S=0.006 1×身高 +0.012 4×體重－0.009 9(S為體表面積，單位:m2;H為身高，單位:cm;W為體重，單位:kg)計算體重為50 kg，身高170 cm人的體表面積為1.647 1 m2。奈達(dá)鉑的化療劑量為100 mg/m2，因此化療量為1.647 1×100=164.71 mg。細(xì)胞外液約占體重的20%，即50×20%=10 L，即病人體內(nèi)藥物濃度為16.471μg/ml，所以設(shè)計奈達(dá)鉑的濃度梯度為 7.5，15，30，45，60 μg/ml。同理得出欖香烯的梯度為 25，50，100，150，200 μg/ml。

1.4 MTT法檢測HeLa細(xì)胞的增殖情況

對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)將細(xì)胞濃度調(diào)為1×105/ml細(xì)胞懸液后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100μl，放在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁長滿孔底后，更換培養(yǎng)基，并且每孔分別加入無菌β－欖香烯，使終濃度達(dá)到25，50，100，150，200 μg/ml;奈達(dá)鉑溶于PBS 中，使終濃度達(dá)到 7.5，15，30，45，60 μg/ml。每一濃度設(shè)3個復(fù)孔，另設(shè)空白對照組。此外，每一濃度分別設(shè)立單加培養(yǎng)基、藥物，不加細(xì)胞的對照組，用來判定藥物本身是否會和MTT反應(yīng)而影響實驗結(jié)果。單獨作用24 h、48 h，去培養(yǎng)基，用PBS將每個孔洗三遍(以排除藥物對光密度值產(chǎn)生的影響)、加入200μl培養(yǎng)基后，每孔加20μl 5 mg/ml MTT溶液，孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜180μl，在微型混合器上振蕩10 min后于全自動酶標(biāo)儀上測定490 nm OD值。實驗重復(fù)三次，取均值計算增殖抑制率。增殖抑制率=(1－OD藥物組/OD對照組)×100%。

1.5 聯(lián)合用藥濃度的選擇

根據(jù)繪制出的增殖曲線，結(jié)合臨床上使用奈達(dá)鉑［6］和 β－欖香烯［7］的不同劑量和最大耐受量，我們選擇奈達(dá)鉑的最適濃度為15μg/ml，β－欖香烯的最適濃度為150μg/ml。

1.6 MTT法檢測奈達(dá)鉑聯(lián)合β－欖香烯乳對HeLa細(xì)胞的增殖情況

方法同1.4，共分四組作用24 h、48 h。A 組:β－欖香烯乳(150μg/ml)，B組:奈達(dá)鉑(15μg/m)，C組:聯(lián)合用藥組(濃度同前兩組)，D組:空白對照組。每一濃度設(shè)4個復(fù)孔。實驗重復(fù)三次，取均值計算增殖抑制率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測聯(lián)合用藥時細(xì)胞的凋亡情況

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)將細(xì)胞濃度調(diào)為1×106/ml細(xì)胞懸液后，接種于6孔板。共分四組，A組:β－欖香烯(150μg/ml)，B組:奈達(dá)鉑組(15μg/m)，C組:聯(lián)合用藥組(濃度同前兩組)，D組:空白對照組，每孔加細(xì)胞懸液2 ml，放在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁長到70%－80%后，按照不同組別分別加入奈達(dá)鉑和β－欖香烯。

使用Bection Dickinson公司流式細(xì)胞儀，按照說明書收集加藥后24 h的細(xì)胞上清和貼壁細(xì)胞(懸浮細(xì)胞直接收集到離心管中，貼壁細(xì)胞用胰酶消化)，細(xì)胞數(shù)不少于5×105個。常規(guī)離心(1 000 r/min)離心5 min，用PBS將細(xì)胞洗3遍，離心，倒掉上清后混勻。根據(jù)AnnexinⅤ－FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒說明，取195μl細(xì)胞懸液，加入5μl AnnexinⅤ－FITC混勻，室溫反應(yīng)10 min，PBS洗細(xì)胞一次，再以190μl稀釋的結(jié)合緩沖液重懸，加10μl碘化丙啶染色液(PI)，輕輕混勻，隨即用流式細(xì)胞儀分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

不同反應(yīng)時間以及藥物在不同作用時間OD值的差別用t檢驗。采用單因素方差分析(one way ANOVA)比較各組均數(shù)之間的差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞儀分析采集軟件:BD FACSDiva Software，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用兩藥相互作用系數(shù)(CDI)評價兩藥相互作用性質(zhì)，CDI=E/(A×B)，E是兩藥聯(lián)合組與對照組吸光度比值，A或B是各單藥組與對照組吸光度的比值。如果CDI＜1，則兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同;如果CDI=1，則兩藥作用性質(zhì)為相加;如果CDI＞1，則兩藥作用性質(zhì)為拮抗。

2 結(jié)果

2.1 奈達(dá)鉑和β-欖香烯乳對HeLa細(xì)胞增殖的影響

奈達(dá)鉑(圖1)和β－欖香烯(圖2)對HeLa細(xì)胞均有顯著抑制作用，通過單因素方差分析認(rèn)為欖香烯和奈達(dá)鉑分別作用的6個處理組的光密度值總體均數(shù)不全相等，即不同劑量藥物對HeLa細(xì)胞增殖抑制有影響。

圖1 奈達(dá)鉑對HeLa細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of nedaplatin on the proliferation of HeLa cells

圖2 β－欖香烯對HeLa細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effect ofβ-elemene on the proliferation of HeLa cell

2.2 奈達(dá)鉑聯(lián)合β－欖香烯乳對HeLa細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組24 h抑制率為(52.70±6.76)%，高于欖香烯組(26.39±5.79)%和奈達(dá)鉑組(0.82±5.79)%;48 h聯(lián)合用藥抑制率為(67.04±3.78)% ，高于欖香烯組(54.44±2.00)%和奈達(dá)鉑組(31.21±4.63)%(圖3)。聯(lián)合用藥組對HeLa細(xì)胞有顯著抑制作用，抑制率均大于單獨用藥(P＜0.01)。24h和48 h的CDI值依次為 0.65、1.05。

圖3 聯(lián)合用藥對HeLa細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect ofβ-elemene combined with nedaplatin on the proliferation of HeLa cell

2.3 聯(lián)合用藥對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組在24 h后細(xì)胞的凋亡率凋亡(B2+B4)雖然不高，但是死細(xì)胞(B1)較多(見圖4)，一方面與欖香烯的細(xì)胞毒性有關(guān)，另一方面，可能與檢測的時間點有關(guān)。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率在我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中最高，目前主要的治療方法是手術(shù)切除和放療，對化療相對不敏感，故化療效果難以令人滿意［8］。尋找一種副作用較小、化療增效且病人可以耐受的方案顯得很重要。β－欖香烯 (β-elemene)是從姜科植物溫郁金中提取的抗癌有效成分，在用藥過程中不發(fā)生骨髓抑制。對肝癌 HepG2細(xì)胞［9］、胃癌［10］、乳腺癌［11］等有較好的抑制作用。在本實驗中，用β－欖香烯和適當(dāng)劑量的奈達(dá)鉑聯(lián)合使用其抑制作用顯著高于單獨使用奈達(dá)鉑。奈達(dá)鉑(nedaplatin)配伍參加大多數(shù)化療方案，副作用較小，但是在使用期間依然會發(fā)生過敏反應(yīng)［12，13］。其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制和順鉑相似，都是破壞DNA復(fù)制而抑制細(xì)胞增殖。不同濃度奈達(dá)鉑對細(xì)胞的影響有差異性，低劑量的奈達(dá)鉑可能導(dǎo)致細(xì)胞的耐藥，這種耐藥主要是通過DNA的損傷修復(fù)能力增強(qiáng)產(chǎn)生的［14］。欖香烯可以通過影響PI3－K－Akt/PKB和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制細(xì)胞增殖［15－17］，并且可以使細(xì)胞周期阻滯在 G0/G1期［18］。

在本實驗中，用MTT法分別檢測了奈達(dá)鉑和β-欖香烯對HeLa細(xì)胞的抑制作用，β－欖香烯對He-La細(xì)胞確實有抑制作用是毋庸置疑的，但是其抑制率仍然值得商榷，因為MTT法測得的結(jié)果還可能受下列因素的影響:①藥物的放置時間和保存方式，欖香烯的規(guī)格為20 ml，一次實驗中不可能將其全部用完，剩余的藥物保存在血清瓶中，擰緊瓶蓋，貼上封口膜放置于4℃冰箱，雖然再次使用該藥和上次使用時間間隔很短，但依然無法確保這樣做不會對實驗產(chǎn)生影響。②欖香烯是乳白色液體，我們通過設(shè)計單加培養(yǎng)基和藥物，不加細(xì)胞的對照組證實該劑量的β－欖香烯不會和MTT反應(yīng)，并且我們在加入MTT之前將細(xì)胞用PBS洗三次，去除了培養(yǎng)基中的β－欖香烯，但是有部分殘留在細(xì)胞內(nèi)的β－欖香烯會對最終的光密度值產(chǎn)生影響。此外，不同生長狀態(tài)的細(xì)胞和細(xì)胞密度可能對相同濃度的藥物的敏感性不同，這還需要更多的研究來證實。

圖1顯示，24 h時7.5和15μg/ml濃度所對應(yīng)的抑制率依次為(－3.89±0.94)%、(－4.44±2.15)%，即，該濃度藥物對細(xì)胞抑制作用不明顯。其可能的原因如下:藥物作用時間太短，細(xì)胞因受到刺激產(chǎn)生某種方式的代償，細(xì)胞代謝增強(qiáng)，線粒體活性增加，產(chǎn)生較多的藍(lán)紫色結(jié)晶，使OD值增加，抑制率變?yōu)樨?fù)值。但是隨著藥物作用時間的延長，最終使細(xì)胞活性受到抑制。

在聯(lián)合用藥時，β－欖香烯150μg/ml 24 h、48 h的抑制率依次為:(26.39±5.79)%，(54.44±2.00)%，高于圖2中所示結(jié)果，這種誤差可能來自于實驗者操作上的差異，也可能來自不標(biāo)準(zhǔn)的儀器，也可能來自外環(huán)境非實驗因素的不平衡等。我們已經(jīng)多次重復(fù)，并且盡力消除這種誤差。

在使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡時，通過AnnexinⅤ/PI雙染色法來檢測細(xì)胞凋亡。其原理是在細(xì)胞凋亡早期，磷脂腺絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，PS暴露在細(xì)胞膜外表面，AnnexinⅤ易于和PS結(jié)合，利用此特性，將AnnexinⅤ標(biāo)記熒光來檢測早期凋亡的細(xì)胞。本研究中最終只使用了195μl的細(xì)胞懸液，依然有大量的細(xì)胞未被使用，盡管細(xì)胞已經(jīng)被混勻，但是這195μl的細(xì)胞懸液依然不能完全代表該組細(xì)胞的凋亡情況。此外，在本實驗中，我們檢測了加藥后24 h細(xì)胞的凋亡情況，這僅僅只能反映出24 h的凋亡情況，藥物導(dǎo)致細(xì)胞的具體凋亡過程我們依然不能確切的全部知曉。有研究報道，β－欖香烯除了會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡之外，也有直接的細(xì)胞毒性作用。

聯(lián)合用藥時，其24 h CDI=0.65＜1，即兩藥可協(xié)同抑制細(xì)胞增殖;48 h CDI=1.05＞1，盡管其大于1，但是僅僅只高出0.05，我們還要考慮到標(biāo)準(zhǔn)誤，所以我們不能認(rèn)為此時兩藥是相互拮抗的。單從抑制率的角度講，聯(lián)合用藥時，其抑制率確實高于單獨用藥。

本實驗通過奈達(dá)鉑和β－欖香烯聯(lián)合使用，以體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞為模型，通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)奈達(dá)鉑聯(lián)合β－欖香烯可以協(xié)同促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，下一步我們將進(jìn)一步明確β－欖香烯聯(lián)合奈達(dá)鉑抑制HeLa細(xì)胞增殖及促凋亡的機(jī)制。

致謝:真誠感謝第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系放射醫(yī)學(xué)教研室郭國禎主任，王晉副教授，感謝他們在實驗平臺、技術(shù)等多方面給予的指導(dǎo)和幫助。

［1］Su XY，Yin HT，Li SY，etal.Intervention effects of nedaplatin and cisplatin on proliferation and apoptosis of human tumour cells in vitro［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(9):4531－4536.

［2］馬東禮，肖家祁，童善慶，等.欖香烯誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，20(6):484－487.

［3］陳小軍，顧立剛，李佩文，等.欖香烯乳對人宮頸癌Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ELK1及其靶基因的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(1):26－27.

［4］陳光，丁曉飛，肖晉芳，等.欖香烯衍生物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(2):246－250.

［5］佟富中，喬新民，劉宏軍，等.欖香烯乳對化療藥物引起的骨髓抑制的改善和預(yù)防作用的臨床比較觀察［J］.中國腫瘤臨床，1999，26(7):50－51.

［6］程斌，王增，翁琳.奈達(dá)鉑小劑量多次給藥與大劑量單次給藥的不良反應(yīng)比較［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2011，20(2):114－116.

［7］王子平，儲大同，劉雨桃，等.欖香烯乳注射液耐受性試驗Ⅰ期臨床研究［J］.中國新藥雜志，2006，15(21):1867－1870.

［8］周潔晶，齊宇紅，邵秋菊，等.宮頸癌術(shù)后腹壁切口種植轉(zhuǎn)移1例報告及分析［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，44(8):669－670.

［9］Mao Y，Zhang J，Hou L，etal.The effect of beta-elemene on alpha-tubulin polymerization in human hepatoma HepG2 cells［J］.Chin JCancer Res，2013，25(6):770－776.

［10］Yan B，Zhou Y，F(xiàn)eng S，etal.Beta-elemene-attenuated tumor angiogenesis by targeting notch－1 in gastric cancer stem-like cells［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:268468.

［11］Zhang X，Li Y，Zhang Y，etal.Beta-elemene blocks epithelialmesenchymal transition in human breast cancer cell line MCF－7 through Smad3-9mediated down-regulation of nuclear transcription factors［J］.PLoSOne，2013，8(3):e58719.

［12］Yamamoto G，Shimada T，Nishida T，etal.［Evaluation of a combination chemotherapy with nedaplatin and 5－FU for oral cancers］［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2001，28(8):1111－1115.

［13］彭莉貞，羅琳，吳云燕.奈達(dá)鉑治療宮頸癌15例過敏反應(yīng)分析［J］.實用臨床醫(yī)學(xué)，2011，12(7):66－68.

［14］李建旺，李邦華.切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1與鉑類耐藥的研究進(jìn)展［J］.江西醫(yī)藥，2009，44(6):625－628.

［15］李蕾，胡雪君.β－欖香烯通過抑制PI3K/Akt及Erk1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡并上調(diào)CbI－b，c－CbI蛋白表達(dá)［C］.廣州:第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議，2011.

［16］張曄，曲秀娟，劉云鵬，等.β－欖香烯對人胃癌SGC7901/Adr細(xì)胞ERK通路的活化和GST－π表達(dá)的影響［J］.世界華人消化雜志，2011，19(13):1394－1397.

［17］趙永順，董斌，吳春明，等.欖香烯阻礙大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞ERK信號通路中Hsp90/Raf－1分子復(fù)合體的形成［J］.實用藥物與臨床，2011，14(4):274－276.

［18］陳光，丁曉飛，肖晉芳，等.欖香烯衍生物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(2):246－250.