王艷海， 段寶生， 巴特爾， 張 靜， 趙 娜

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)鄂爾多斯臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是臨床常見的重要病原菌，具有多重耐藥性，由其引起的臨床感染所占的比例呈逐年上升的趨勢，給臨床治療帶來極大困難。MRSA的致病能力強，可引起菌血癥、敗血癥、中毒休克綜合征等多種進行性、壞死性疾?。?-2］。來自全球監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示MRSA的發(fā)生率達40%～50%，而且不同種族、不同地區(qū)來源的MRSA在致病性、耐藥性及基因多態(tài)性等方面有顯著差異［3］。因此，了解各民族、各地區(qū)MRSA的分子流行特征為制定預(yù)防措施及有效防止MRSA的爆發(fā)流行具有十分重要的意義。本研究通過葡萄球菌染色體mec(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCC mec)基因分型、多位點序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)及殺白細胞毒素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)毒力基因(pvl)檢測等技術(shù)，對鄂爾多斯地區(qū)蒙古族54株MRSA菌株進行基因分型研究，同時與主要流行克隆株進行比較和分析，以了解本地區(qū)MRSA的分子生物學(xué)特征。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源 收集2009年1月至2011年8月在鄂爾多斯市中心醫(yī)院門診及住院的蒙古族患者，連續(xù)分離不重復(fù)血、腹腔滲出液、封閉膿汁、下呼吸道痰標(biāo)本、支氣管灌洗液以及尿液、傷口分泌物等標(biāo)本MRSA分離株共54株，均經(jīng)VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定，同時使用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)［4］推薦的頭孢西丁紙片擴散法驗證MRSA，判讀標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑≤19 mm。mecA基因檢測均陽性。金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)質(zhì)控菌株購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

2.儀器與試劑 美國貝克曼公司的超速低溫離心機;美國Alpha Innotech有限公司的紫外凝膠成像儀;Gene Amp基因有限公司 PCR9700;BIO-RAD電泳儀;細菌基因組提取試劑盒購于上海生物工程有限公司;Taq酶、Marker及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)試劑購于寶泰克生物科技有限公司;PCR所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

二、方法

1.細菌基因組提取 采用上海生物工程有限公司的細菌基因組提取試劑盒，依照說明提取基因組DNA，產(chǎn)物保存－70℃冰箱中備用。

2.SCC mec基因分型 多重PCR引物及反應(yīng)體系等參數(shù)參照文獻［5］進行。使用Gene Amp基因有限公司PCR9700進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色，紫外凝膠成像儀觀察是否出現(xiàn)目的條帶，并拍照成像。PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司純化并雙向測序，測序結(jié)果在網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nih.gov/)進行BLAST對比，明確其基因型。

3.PVL毒力基因檢測 每株MRSA均PCR進行毒力篩查，引物及反應(yīng)體系等參數(shù)參照文獻［6］，基因片段位于第1 640～2 072位點，擴增產(chǎn)物為433 bp。擴增產(chǎn)物電泳后全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。擴增陽性產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。

4.MLST 7個管家基因分別是 arcc、aroe、glp、guk、pta、tpi和 yqil，其擴增引物及反應(yīng)參數(shù)參照文獻［7］進行。電泳、測序、序列比對同前，測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行比對后，將結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net)，比較每個多態(tài)性位點的等位基因，獲得序列號(ST)，并與已知的MRSA流行株進行比較和分析。

結(jié) 果

一、SCC mec分型結(jié)果

對鄂爾多斯地區(qū)蒙古族54株MRSA菌株進行SCC mec基因分型，SCC mecⅡ型 27株，占50.00%，SCC mecⅢ型 25 株，占 46.30%;SCC mecⅣ型 1株，占1.85%;SCC mecⅤ型 1株，占1.85%;未檢測到SCC mecⅠ型菌株。Ⅱ～Ⅴ型測序結(jié)果與GenBank BLAST比對，結(jié)果分別與參考序列D86934、AB37671、AB063172、AB12121一致。SCC mecⅤ型代表菌株測序圖譜見圖1。

二、pvl基因檢測結(jié)果

54株MRSA均進行了pvl基因的PCR擴增，結(jié)果顯示僅1株SCCmecⅣ型MRSA菌株的pvl基因陽性，分離率為1.85%，代表株測序圖譜見圖2，其余菌株均為陰性。

三、MLST結(jié)果

挑選27株 MRSA進行 MLST分型，其中SCC mecⅢ型14株，SCC mecⅡ型11株，SCC mecⅣ型1株，SCC mecⅤ型1株。有24株MRSA成功進行分型，其中有1株 SCC mecⅢ型和2株SCC mecⅡ型未能進行MLST分型。24株MRSA共有 4種序列型，其中 13株為ST239，占54.17%;9株為ST5，占 37.50%;ST59和 ST7 各1株，占4.17%。通過eBURST軟件繪制了所測試的24株菌株和不同ST型別之間的系統(tǒng)進化樹，見圖3～圖5。同時，SCC mec基因型與MLST分型結(jié)果之間具有一定的關(guān)聯(lián)性，見表1。

圖1 MRSA菌株SCC mecⅤ型測序序列圖譜

圖2 MRSA菌株pvl基因測序序列圖譜

圖3 ST239的克隆復(fù)合體分析圖譜

圖4 ST5的克隆復(fù)合體分析圖譜

圖5 ST59的克隆復(fù)合體分析圖譜

表1 SCC mec基因型與MLST分型的對應(yīng)關(guān)系

討 論

1961年Jevons在英國首次發(fā)現(xiàn)MRSA，20世紀60年代中期MRSA擴展到歐洲許多國家及加拿大，20世紀70年代末急劇增多遍及全世界，并引起爆發(fā)流行，成為全球性問題［8］。不同國家、不同地區(qū)間流行的 MRSA基因型不同，目前SCC mec分型成為最常用的分型方法之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究，依照SCC mec各基因組分的多態(tài)性將SCC mec分為Ⅰ～XI型［9］，根據(jù)無功能區(qū)的不同又可以分為不同的亞型。本研究對鄂爾多斯地區(qū)蒙古族患者進行SCC mec分型，結(jié)果顯示SCC mecⅡ型和Ⅲ型是本地區(qū)的主要型別，分別占50.00%和46.30%。這與國內(nèi)、外相關(guān)報道相近［10-11］，表明本地區(qū)蒙古族人群MRSA分子流行病學(xué)特征仍與主要流行株一致。在治療方面，有國內(nèi)外相關(guān)經(jīng)驗可以借鑒，如吳愛武報道的MRSA對克林霉素、β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物100%耐藥，而對其他藥物表現(xiàn)為多重耐藥［12］。本研究還發(fā)現(xiàn)Ⅳ型和Ⅴ型各1例菌株，特別是Ⅴ型在國內(nèi)蒙古族人群中很少見到報道，但Ⅳ型和Ⅴ型在歐洲某些國家為主要表型［13］，表明與國外流行株有交叉，原因可能與鄂爾多斯地區(qū)的地理位置與蒙古國毗鄰及其過快的發(fā)展速度有關(guān)，導(dǎo)致來源于世界流行株在本地區(qū)攜帶傳播。隨著國家和地區(qū)間經(jīng)濟文化交流的日益頻繁，感染更具有復(fù)雜性和多樣性。同時，有研究報道SCC mec分型是區(qū)分醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的一個重要指標(biāo)，但是本地區(qū)蒙古族人群及門診標(biāo)本較分散，不利于調(diào)查隨訪，而且社區(qū)獲得性感染標(biāo)準(zhǔn)國際與我國尚未統(tǒng)一，不利于區(qū)分。因此，我們應(yīng)該通過加大樣本量等措施，進一步探明本地區(qū)社區(qū)獲得性感染MRSA流行株的SCC mec型別、分布情況及抗菌藥物耐藥的攜帶情況，這有待我們進一步研究探討。

PVL是一種與致病力相關(guān)的外毒素，能與葡萄球菌細胞表面結(jié)合，直接導(dǎo)致皮膚及軟組織感染、壞死性肺炎、壞死性筋膜炎等嚴重壞死性疾病［14］，對MRSA進行 pvl基因檢測尤其重要。本研究對所有MRSA進行了pvl基因的PCR擴增，結(jié)果顯示僅1株MRSA的pvl基因陽性，其他均未檢出pvl基因，可能與pvl基因為社區(qū)獲得性感染特有的標(biāo)志有關(guān)。有研究顯示，世界上流行的社區(qū)獲得性感染MRSA產(chǎn)pvl的比例高達77%～100%［15］，而在醫(yī)院感染MRSA中pvl基因的檢出率＜0.5%。又如 Zhang等［5］進行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)所有117株社區(qū)獲得性感染MRSA均包含pvl基因，而醫(yī)院MRSA菌株pvl基因均未檢測出。本次研究中，pvl基因擴增陽性率較低的原因，可能和地域特征及民族特征有一定的關(guān)系，不同地區(qū)、不同民族的陽性率可能也不同［16］。同時本研究發(fā)現(xiàn)的pvl陽性菌株是SCC mecⅣ型，這也揭示pvl陰陽性結(jié)果可以初步作為區(qū)分社區(qū)獲得性感染MRSA和醫(yī)院感染MRSA標(biāo)準(zhǔn)之一，因為Ⅳ、Ⅴ型多見于社區(qū)獲得性感染MRSA［17］。

目前，國際上主要有5個MRSA克隆株［18］，包括巴西/匈牙利克隆株、伊比利亞克隆株、紐約/日本克隆株及兒童克隆株。本研究通過對24株MRSA菌株進行MLST，總共發(fā)現(xiàn)4個不同的ST型，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)MRSA菌株主要由兩大克隆株進化而來，一個為SCC mecⅢ-ST239，歸屬于CC8克隆復(fù)合體，來源于巴西/匈牙利克隆株，是亞洲地區(qū)亦是國內(nèi)其他地區(qū)廣泛流行的克隆株;另一個為SCC mecⅡ-ST5，歸屬于CC5克隆復(fù)合體，來源于紐約/日本克隆株，是在韓國和日本廣泛流行的克隆株;另外本地區(qū)的Ⅳ型菌株為SCC mecⅣ-ST59，歸屬于CC59克隆復(fù)合體，與美國、新加坡及中國臺灣地區(qū)廣泛傳播的社區(qū)獲得性感染MRSA克隆株相同［19］，考慮為輸入性病例引發(fā)疾病所致;SCC mecⅤ型菌株為ST7型，因數(shù)據(jù)有限，尚無法追蹤其根源。

綜上所述，本研究通過SCC mec分型、pvl基因檢測及MLST 3種方法，發(fā)現(xiàn)鄂爾多斯地區(qū)蒙古族人群MRSA并非是單一流行株，而以SCC mecⅢ型和SCC mecⅡ型兩大克隆株為主，另外近年來在歐美地區(qū)迅速流行的SCC mecⅣ、Ⅴ型菌株也已經(jīng)通過各種途徑傳播到本地區(qū)。本研究不足之處在于社區(qū)獲得性感染MRSA患者多在門診或急診科就診，通?；颊邇H僅進行簡單的外科處理或經(jīng)驗性用藥，很少送檢，造成檢出率較低，而且毒力基因的檢測僅局限于pvl，而沒有對其他毒力基因如hla、hlb、clf及fnb等進行檢測。另外，進行MLST分型的菌株數(shù)量較少，均有待于我們進一步完善研究。

［1］Forcade NA，Parchman ML，Jorgensen JH，etal.Prevalence，severity，and treatment of communityacquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus(CA-MRSA)skin and soft tissue infections in 10 medical clinics in Texas:a South Texas Ambulatory Research Network(STARNet)study［J］.J Am Board Fam Med，2011，24(5):543-550.

［2］Nonga BN，Jemea B，Tambo FM，etal.Feasibility of a simple drainage system in Cameroonian children after thoracotomy and decortication for empyema thoracis［J］.Afr J Paediatr Surg，2012，9(1):27-31.

［3］Chongtrakool P，Ito T，Ma XX，etal.Staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec)typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated in 11 Asian countries:a proposal for a new nomenclature for SCCmec elements［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(3):1001-1012.

［4］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial testing;twentysecond informational supplement［S］.M100-S22，CLSI，2008.

［5］Zhang K，McClure JA，Elsayed S，etal.Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec typesⅠtoⅤin methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(10):5026-5033.

［6］Lina G，Piémont Y，Godail-Gamot F，etal.Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia［J］.Clin Infect Dis，1999，29(5):1128-1132.

［7］Enright MC，Day NP，Davies CE，etal.Multilocus sequence typing for characterization of methicillinresistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus［J］.JClin Microbiol，2000，38(3):1008-1015.

［8］Vyas K，Hospenthal DR，Mende K，etal.Recurrent community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in an HIV-infected person［J］.JClin Microbiol，2011，49(5):2047-2053.

［9］Li S，Skov RL，Han X，etal.Novel types of staphylococcal cassette chromosome mec elements identified in clonal complex 398 methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(6):3046-3050.

［10］師志云，趙志軍，賈 偉，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子流行病學(xué)研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21(14):2886-2888.

［11］Ko KS，Lee JY，Suh JY，etal.Distribution of major genotypes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Asian countries［J］.J Clin Microbiol，2005，43(1):421-426.

［12］吳愛武，招志翔，林紅燕.金黃色葡萄球菌的藥敏表型和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的SCCmec基因分型［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25(12):934-939.

［13］Huijsdens XW，van Santen-Verheuvel MG，Spalburg E，etal.Multiple cases of familial transmission of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.JClin Microbiol，2006，44(8):2994-2996.

［14］Hou Z，Zhou Y，Wang H，etal.Co-blockade of mecR1/blaR1 signal pathway to restore antibiotic susceptibility in clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Arch Med Sci，2011，7(3):414-422.

［15］Nass T，F(xiàn)ortineau N，Spicq C，etal.Three-year survey of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus producing Panton-Valentine leukocidin in a French university hospital［J］.J Hosp Infect，2005，61(4):321-329.

［16］Boyle-Vavra S，Daum RS.Community-acquired methicillin-resistant Staphylocococcus aureus:the role of Panton-Valentine leukocidin［J］.Lab Invest，2007，87(1):3-9.

［17］林 萍，孫 陽，韓立中，等.殺白細胞素pvl基因陰性MRSA對抗菌藥物的耐藥性研究［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26(5):295-298.

［18］Cha HY，Moon DC，Choi CH，etal.Prevalence of the ST239 clone of methicillin-rethicllin-resistant Staphylococcus aureus and differences in antimicrobial susceptibilities of ST239 and ST5 clones identified in a Korean hospital［J］.J Clin Microbiol，2005，43(8):3610-3614.

［19］McClure JA，Conly JM，Lau V，etal.Novel muhiplex PCR assay for detection of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leukocidin genes and simultaneous discrimination of methicillin-susceptible from-resistant staphylococci［J］.J Clin Microbiol，2006，44(3):1141-1144.