徐國強，陳修來，吳滿珍

1(江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

C4二元羧酸(蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸等)在食品、醫(yī)藥、材料等行業(yè)有著重要的應用價值。2004年，美國能源部專門成立了1，4-二羧酸組，研究蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸的生產(chǎn)工藝和應用［1］。以可再生生物質(zhì)為原料的微生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)C4二元羧酸的生產(chǎn)工藝具有原料來源廣泛、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢，因而備受各國研究人員的關注。釀酒酵母作為一種真核模式微生物，具有以下優(yōu)點:(1)營養(yǎng)需求簡單、易于培養(yǎng)、下游分離提取工藝低廉;(2)能夠耐受較低的pH條件和高濃度的底物產(chǎn)生的滲透壓脅迫;(3)長期用于食品、釀造等行業(yè)，被美國FDA認證為GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物，發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性［2］。因此，釀酒酵母被認為是生產(chǎn)C4二元羧酸的潛在最適微生物。

然而，釀酒酵母本身并不具備過量積累C4二元羧酸的代謝途徑，而且在分批發(fā)酵中容易生成大量的副產(chǎn)物乙醇。這是釀酒酵母生產(chǎn)C4二元羧酸所面臨的兩大挑戰(zhàn)［3］。釀酒酵母可以分別通過線粒體氧化途徑［4］和胞質(zhì)還原途徑［5］來積累 C4二元羧酸，或者同時利用這兩種途徑來積累目標羧酸［6］。但是，對于以C4二元羧酸為目標產(chǎn)物來說，乙醇的產(chǎn)生導致了碳流的損失。針對這一難題，國外研究者主要采用了兩種策略。一是敲除編碼乙醇脫氫酶的ADH1-4基因，但這種策略不但沒有消除乙醇的產(chǎn)生，還導致了甘油和乙醛的積累。二是敲除丙酮酸脫羧酶的關鍵基因PDC1，5，6，這種策略可以阻斷乙醇的合成代謝，但導致細胞不能在高糖濃度條件下進行分批發(fā)酵［7］。荷蘭代爾夫特工業(yè)大學的Pronk課題組，采用該策略獲得的菌株在恒化條件下，通過添加乙酸和乙醇等二碳化合物，可以正常生長，但工藝較為復雜，且發(fā)酵周期較長［8－9］。

輔因子(如維生素、NADH等)水平在調(diào)控各種生化反應及碳代謝流方面扮演著重要的角色［10］。如圖1所示，作為一種重要的輔因子，硫胺素的活性形式是硫胺素二磷酸(ThDP)，而ThDP同為丙酮酸脫羧酶和丙酮酸脫氫酶復合體的輔因子［11］，THI2是硫胺素合成途徑中正調(diào)控因子［12］。NADH是碳代謝的關鍵輔因子。通過調(diào)控微生物細胞內(nèi)輔因子的形式和水平，可以定向改變微生物細胞的代謝流。

該研究通過敲除THI2基因，阻斷硫胺素的合成途徑，并通過外源添加適量的硫胺素二磷酸，弱化丙酮酸的進一步代謝，以達到減少副產(chǎn)物乙醇的目的，在此基礎上，通過外源添加NAD+，調(diào)控胞內(nèi)NAD+/NADH比率，進一步促進糖代謝和菌體生長。

圖1 釀酒酵母中乙醇合成途徑、硫胺酸代謝途徑和THI調(diào)控機制的相互關系［5］Fig.1 The relationships among the ethanol pathway，thiamine metabolism and THI regulatory system in S.cerevisiae.(a)Thiamine diphosphate(ThDP)in yeast pyruvate metabolism;(b)Schematic outline of thiamine metabolism in yeast;(c)A hypothetical model of the yeast THI regulatory system

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C、敲除用質(zhì)粒pUG27、標記回收質(zhì)粒pSH47相關信息見表1。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g，Yeast Nitrogen Base(without(NH4)2SO4)1.7 g，(NH4)2SO45 g，加水定容到1 000 mL，pH5.5，瓊脂粉 20 g，115 ℃條件下滅菌15 min。倒平板前根據(jù)酵母的缺陷營養(yǎng)標記相應加入適量的滅過菌的氨基酸、嘌呤和嘧啶。

種子培養(yǎng)基:酵母粉10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖20，用1 000 mL水定容，pH自然，115℃條件下滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 60，NH4Cl 7，KH2PO45，MgSO4·7H2O 0.8，CaCO340，微量元素10 mL，pH5.0，115℃滅菌20 min，裝液量為100 mL/250 mL，ThDP 單獨添加，0.04 μmol/L。根據(jù)酵母的缺陷營養(yǎng)標記相應加入適量的滅過菌的氨基酸、嘌呤和嘧啶。

微量元素母液:稱取 FeSO4·7H2O 2 g，CuSO4·5H2O 0.05 g，MnCl2·4H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 2 g，ZnCl20.5 g，用2 mol/L HCl溶液溶解后定容到1 000 mL，4 ℃保存。

表1 該研究所用的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Lists of strains，plasmids and primers used in this study

1.3 培養(yǎng)方法

保藏于甘油管里的酵母菌種經(jīng)活化后接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，離心棄上清，用無菌水洗滌1次，按4%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。置入30℃搖床培養(yǎng)，200 r/min，分別于4、8、12 h取樣，取樣后(此時為對數(shù)生長中期)，添加不同濃度的 NAD+(200、1 000、5 000 μg/L)，然后于16、24、36、48、60、72、84、96 h 取樣，每次 1.0 mL，其中0.2 mL用于測定生物量(用1.0 mol/L的HCl溶解殘留的Ca2CO3)，0.8 mL用于代謝物的檢測。

1.4 工程菌株的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pUG27為模板，利用引物 THI2-F和THI2-R(表1)進行PCR擴增，PCR條件為94℃ 5 min;94℃ 30 s;55℃ 30 s，72℃ 2 min，29個循環(huán);72℃延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物即為敲除盒，它包含有標記基因kanMX，loxP位點和THI2基因同源的序列。然后利用LiAc轉(zhuǎn)化法將敲除盒直接轉(zhuǎn)化到S.cerevisiae CEN.PK2-1C，涂布在SD(His-)平板上，培養(yǎng)3～5 d。長出的單菌落，接入SD(His-)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后提取基因組，PCR驗證確定為陽性菌落?？紤]到進一步的代謝改造需要篩選標記，將用以消除標記的Cre表達質(zhì)粒pSH47轉(zhuǎn)化到酵母陽性轉(zhuǎn)化子中，切除標記后，并將pSH47移除，最終獲得的陽性轉(zhuǎn)化子，將其命名為FMME-002△THI2。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的測定

取0.2 mL混合均勻的發(fā)酵液，用0.25 mol/L的HCl除掉發(fā)酵液中的CaCO3，并稀釋適當?shù)谋稊?shù)，振蕩混勻。待溶液澄清后，以稀HCl為空白，在600 nm波長處測定吸光值，以測得的OD值作為菌體生物量。

1.5.2 代謝物分析

HPLC檢測代謝物，葡萄糖、乙醇用RID檢測器;色譜柱為 Aminex HPX-87H，流動相為體積分數(shù)為0.0275%的H2SO4。

2 結(jié)果與討論

2.1 THI2的敲除對菌株發(fā)酵的影響

考察了硫胺素合成缺陷對乙醇形成及菌株發(fā)酵特性的影響，結(jié)果如表2所示。發(fā)酵進行到96 h時，對照菌株FMME-002可積累乙醇5.27±0.23 g/L;相比之下，THI2敲除后，乙醇產(chǎn)量減少到0.53±0.12 g/L。但是，THI2的敲除，導致了菌體生長的減弱，進入穩(wěn)定期時(24 h)，生物量僅為1.32±0.11，是對照菌株的46.8%;24 h后，F(xiàn)MME-002△THI2幾乎停止消耗葡萄糖，發(fā)酵進行到96 h時，對照菌株FMME-002已將葡萄糖消耗完，而此時FMME-002△THI2仍有約45.80±0.22 g/L的葡萄糖尚未消耗完。

表2 THI2敲除前后生長及代謝物的比較Table 2 Comparison of growth and metabolite yields of FMME-002 and FMME-002△THI2

在該研究中，THI2基因的敲除，阻斷了硫胺素的合成，進而影響了丙酮酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶及α-酮戊二酸脫氫酶的活性。丙酮酸脫氫酶是丙酮酸參與TCA循環(huán)的第一個關鍵酶，而α-酮戊二酸脫氫酶又是TCA循環(huán)的關鍵酶［11］，其活性的下降，會導致TCA循環(huán)的減弱，從而影響菌體的生長。此外，ThDP是HMP途徑總轉(zhuǎn)酮酶的輔酶，當胞內(nèi)硫胺素供應不足時，HMP途徑代謝受阻，而NADPH又是通過HMP途徑代謝產(chǎn)生的，硫胺素的不足會導致NADPH的不足，從而影響到細胞的合成代謝，進而導致葡萄糖的消耗停止［14］。

2.2 VB1的添加對菌株發(fā)酵特性的影響

作為一種重要的輔因子，硫胺素在調(diào)控菌體生長和代謝中扮演著重要的角色。為了既達到減少乙醇的目的，又對生長和葡萄糖消耗不造成過多的影響，進一步考察了外源添加ThDP對菌體發(fā)酵特性的影響，研究結(jié)果如圖2所示。不添加ThDP時，菌體生物量僅有1.56±0.11，乙醇產(chǎn)量為1.87±0.11 g/L，消耗的葡萄糖為17.32±1.14 g/L。相比之下，添加0.04 μmol/L ThDP時，菌體生物量上升到2.24±0.08，乙醇產(chǎn)量上升到2.56±0.15 g/L，葡萄糖消耗量為24.93±0.63 g/L，較不添加時分別提高了43.6%，36.9%，43.9%。盡管進一步提高 ThDP的添加量，可以進一步促進葡萄糖的消耗和菌體生長，但會導致乙醇的產(chǎn)量提高，違背了減少副產(chǎn)物乙醇的目的。

圖2 硫胺素的添加對菌株FMME-002△THI2發(fā)酵特性的影響Fig.2 Effect of thiamine on the growth and compound yields of FMME-002△THI2 during aerobic batch growth on 6%glucose

在外源添加 0.04 μmol/L ThDP的條件下，F(xiàn)MME-002△THI2的菌體生長仍然較弱，且仍有較多的殘?zhí)遣荒鼙幌摹？赡艿脑蛴袃牲c:一是硫胺素的不足影響了HMP途徑的進行，進而影響了細胞的合成代謝;二是糖酵解產(chǎn)生的NADH不能被進一步氧化，導致胞內(nèi)NAD+的不足，影響了糖酵解途徑的進行，進而導致葡萄糖不能被消耗。糖酵解途徑產(chǎn)生的NADH主要通過2種途徑被氧化:一是進入TCA循環(huán)，將電子傳遞個分子氧;二是通過丙酮酸脫氫酶旁路代謝，利用底物水平磷酸化將電子傳遞給乙醛，進而生成乙醇［15］。在該研究中，硫胺素的供應不足同時影響了TCA循環(huán)和丙酮酸脫氫酶旁路代謝，因此，可以通過外源增加NAD+的濃度來維持胞內(nèi)NAD+/NADH的平衡來促進葡萄的消耗。

2.3 NAD+的添加對菌株發(fā)酵特性的影響

考察了在發(fā)酵進行到12 h外源添加不同濃度的NAD+(200、1 000、5 000 μg/L)對菌體生長、葡萄糖消耗等的影響。研究發(fā)現(xiàn)，添加1 000 μg/L NAD+時，對菌體生長、葡萄糖消耗等參數(shù)的促進作用最為顯著，過多的添加NAD+會導致菌體生長和葡萄糖消耗速率有所下降。以下詳細考察了添加1 000 μg/L NAD+對菌株 FMME-002△THI2發(fā)酵特性的影響。結(jié)果如圖3所示，當發(fā)酵進行到12 h，添加1 000 μg/L的NAD+能促進菌體的生長，發(fā)酵進行到48 h時，生物量為3.12±0.11，較對照提高了47.2%(圖3－a);NAD+的添加能明顯地促進葡萄糖的消耗，發(fā)酵進行到96 h時，葡萄糖消耗量為53.8±1.1 g/L，較對照糖耗(36.2±1.2g/L)提高了48.6%(圖3－b);當添加的NAD+的終濃度為1 000 μg/L時，發(fā)酵進行到24 h時，乙醇的積累量為3.12±0.2 g/L，較不添加時(2.56±0.15 g/L)僅提高了0.56 g/L(圖33－c)。

圖3 NAD+的添加對菌株FMME-002△THI2發(fā)酵特性的影響Fig.3 Effect of NAD+on the fermentation profile of the strain FMME-002△THI2

通過調(diào)控NAD+/NADH能有效地調(diào)節(jié)微生物細胞的生長及其代謝功能［16］。Liu等［17］在光滑球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過程添加8 mg/L NAD+合成前體煙酸，使得葡萄糖消耗速率和丙酮酸產(chǎn)量分別提高了48.4%和29%。在該研究中，NAD+的添加有效地促進了葡萄糖的消耗和菌體的生長，同時也沒有明顯促進乙醇的形成。通過這種策略，達到了在對葡萄糖的消耗及菌體生長影響很小的前提下，實現(xiàn)了減少副產(chǎn)物乙醇的形成的目的。

3 結(jié)論

THI2的敲除可以減少乙醇的形成，但極大地影響了葡萄糖的消耗和菌體的生長;外源添加ThDP，可以促進葡萄糖的消耗和菌體的生長，但同時也促進了乙醇的積累;在外源添加少量(0.04 μmol/L)的ThDP 的基礎上，添加適量(1 000 μg/L)的 NAD+，可以明顯地促進葡萄糖的消耗和菌體的生長，但又不會明顯地促進乙醇的積累。因此，通過敲除硫胺素合成途徑中的基因THI2，阻斷硫胺素的合成，同時外源添加少量的ThDP，并通過添加適量的NAD+，可以實現(xiàn)減少乙醇的目標，但又不影響葡萄糖消耗和菌體的生長，是減少副產(chǎn)物乙醇形成的一個有效的策略。

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