張 翼 李 惠 陳 劼 張士虎

1.江蘇省中醫(yī)院急診外科，江蘇南京 210029；2.江蘇省中醫(yī)院病理科，江蘇南京 210029

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，主要包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌，其中甲狀腺乳頭狀癌最常見(jiàn)，約占85%～90%，以女性多發(fā)[1]。由于多種因素，導(dǎo)致甲狀腺腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。良性甲狀腺病變中常出現(xiàn)乳頭狀病變，當(dāng)乳頭出現(xiàn)不典型增生時(shí)易誤診為癌，從而擴(kuò)大手術(shù)范圍，給病人造成不必要的傷害，因此對(duì)其性質(zhì)鑒別具有重要臨床意義。而肉眼及顯微鏡下的觀(guān)察診斷具有一定的主觀(guān)性，這就需要一個(gè)客觀(guān)的臨床檢測(cè)指標(biāo)幫助辨別良惡性。目前多項(xiàng)研究[2,3]指出甲狀腺乳頭狀癌和BRAF V600E突變密切相關(guān)，此突變?cè)诩谞钕倨渌紣盒阅[瘤中突變率非常低，具有一定特異性，而B(niǎo)RAF V600E在甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤中的突變情況尚無(wú)人報(bào)道。為探討B(tài)RAF基因在甲狀腺乳頭狀病變中的突變情況及臨床意義，該研究選取2009年11月—2013年3月以來(lái)到該院就診的56例甲狀腺乳頭狀病變的患者，采用直接測(cè)序法分析了甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤的BRAF基因突變情況，探討其在鑒別診斷中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年11月—2013年3月江蘇省中醫(yī)院病理科54例甲狀腺乳頭狀病變石蠟標(biāo)本,男16例,女38例;平均年齡4419～70歲。其中甲狀腺乳頭狀癌24例（包括微乳頭癌6例）,甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤30例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，診斷參考2004年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。甲狀腺乳頭狀癌患者行單側(cè)及峽部全切加頸部淋巴結(jié)清掃,甲狀腺微小乳頭狀癌患者行單側(cè)及峽部全切加中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，不典型腺瘤行甲狀腺次全切除術(shù)，所有患者目前均存活。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 切取5張10 um厚石蠟白片，脫蠟消化后提取DNA。具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)（Omega FFPE DNA Kit，USA）。以凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)DNA模板的質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 使用ABI-2700型測(cè)序級(jí)擴(kuò)增儀，擴(kuò)增目的基因片段。 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2μL，HotStar Taq DNA Polymerase 0.25μL(Q IAGEN，USA)，5×Q-Solution 4μL,dNTP 2μL,Primer各 1μL,模板 DNA 1μL,去離子水 8.75μL。 95 ℃ 10 min;94℃50 s,57℃ 1 min,72℃1 min,共循環(huán)35次,最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)（AXYPrep PCR Cleanup Kit,USA）。

1.2.3 測(cè)序 測(cè)序方法[5]：在3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序;Data collection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。對(duì)于測(cè)序中發(fā)現(xiàn)有突變的病例,都進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序結(jié)果用DNA sequencing analysis5.1軟件分析原始測(cè)序數(shù)據(jù),獲取測(cè)序電泳圖和序列。將樣品序列用AB I SeqScape軟件與genebank標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì),觀(guān)察樣本基因序列的改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理使用SPSS 13.0軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、Fisher’s確切概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

經(jīng)直接測(cè)序法測(cè)定，54例樣本成功檢測(cè)了BRAF第15外顯子突變情況，突變位點(diǎn)全部位于V600E位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)其他類(lèi)型突變。24例甲狀腺乳頭狀癌，16例發(fā)現(xiàn)BRAF基因15外顯子第600位密碼子A/T雜合（V600E），突變率為 66.7%（16/24）。 而 30例甲狀腺不典型腺瘤樣本中未發(fā)現(xiàn)V600E位點(diǎn)病理性突變（0/30）,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。研究結(jié)果還顯示，BRAF V600E突變與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與組織學(xué)類(lèi)型相關(guān)。見(jiàn)表2。

表1 54例甲狀腺乳頭狀病變樣本中BRAF基因突變率

表2 BRAF基因突變與甲狀腺乳頭狀病變患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌組織光鏡下多表現(xiàn)為乳頭狀，細(xì)胞核毛玻璃樣，可觀(guān)察到核溝，核內(nèi)包涵體，間質(zhì)中含有砂粒體，此為重要的特征。而當(dāng)乳頭由于冰凍處理或者其他原因造成不典型時(shí)與腺瘤難以鑒別。免疫組化可以用于鑒別診斷，但是免疫組化操作過(guò)程中易出現(xiàn)假陰性或者假陽(yáng)性，人工判讀結(jié)果也有一定的主觀(guān)性，易造成誤診。兩者治療和預(yù)后差別很大，需要一個(gè)客觀(guān)的檢測(cè)指標(biāo)。

BRAF基因?yàn)镽AF家族成員，位于7號(hào)染色體，是編碼B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴(lài)性激酶的激酶。研究顯示，BRAF基因第15位外顯子上的T1799A點(diǎn)突變（V600E）導(dǎo)致BRAF中的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替代，進(jìn)而持續(xù)激活BRAF激酶，造成MAPK通路持續(xù)活化，細(xì)胞不斷分裂、增殖，進(jìn)而形成腫瘤[6]。在轉(zhuǎn)基因小鼠中通過(guò)BRAF突變的表達(dá)，可誘導(dǎo)出乳頭狀癌，表明了BRAF基因在乳頭狀癌起始中的重要作用[7]。Fukushima等[8]檢測(cè)了100例甲狀腺癌的BRAF基因突變情況，發(fā)現(xiàn)BRAF基因的突變僅存在甲狀腺乳頭狀癌中，而且僅發(fā)現(xiàn)了V600E突變,陽(yáng)性率為53%(40/76).多項(xiàng)研究[9-11]顯示甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因突變率為29%～87%，而濾泡型腺癌和所有良性病變?nèi)鐔渭冃约谞钕倌[則無(wú)此突變。Zhang[11]等發(fā)現(xiàn)在甲狀腺細(xì)針穿刺標(biāo)本中71.4%發(fā)生BRAF V600E突變，所有BRAF(V600E)陽(yáng)性的標(biāo)本甲狀腺切除術(shù)后都被證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌。最近的研究還顯示，BRAF（V600E）突變的發(fā)生率有地區(qū)差異。例如，BRAF V600E突變率在韓國(guó)（52%～87%）比其他國(guó)家（36%～65%）高[3]。造成這種差異的原因尚不清楚，可能是由于地理因素。一些研究報(bào)道了在高碘攝入?yún)^(qū)BRAF V600E突變率更高，這可能表明碘過(guò)量攝入是乳頭狀癌BRAFV600E突變的一個(gè)危險(xiǎn)因素[12]。

甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后較好，十年生存率超過(guò)90%。但是35%的患者在長(zhǎng)期隨訪(fǎng)中有復(fù)發(fā)[13]。甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后與多種因素相關(guān)，包括年齡、多灶性、腫瘤最大徑、甲狀腺外浸潤(rùn)性的生長(zhǎng)方式及缺乏腫瘤相關(guān)性纖維包膜等。研究顯示BRAF V600E突變?cè)诮?jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌中確與侵犯表型相關(guān)，BRAF V600E影響腫瘤的生長(zhǎng)方式，促進(jìn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移發(fā)生，進(jìn)而影響甲狀腺乳頭狀癌患者臨床預(yù)后[14]。這對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷和治療具有重要意義。Yong[15]等研究顯示73.7%的甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)BRAF V600E突變。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期，多灶性與BRAF V600E突變并無(wú)顯著相關(guān)。然而，腫瘤大小，甲狀腺外侵犯，組織學(xué)類(lèi)型以及并發(fā)橋本氏甲狀腺炎與BRAF V600E突變有關(guān)聯(lián)。在一項(xiàng)回顧性多中心研究中[16]，BRAF V600E突變的存在增加了甲狀腺乳頭狀癌的死亡率。盡管這種聯(lián)系并不是獨(dú)立存在的，但支持了BRAF V600E突變對(duì)甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后和治療影響的進(jìn)一步研究。

綜上所述，BRAF V600E突變?cè)阼b別甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺不典型乳頭狀腺瘤中具有重要意義，對(duì)患者的治療和預(yù)后有指導(dǎo)意義，直接測(cè)序法結(jié)果準(zhǔn)確，價(jià)格低廉，適合臨床推廣使用。

[1]Davies L,Welch HG.Increasing incidence of thyroid cancer in the U-nited States[J].JAMA,2006,295(18):2164–2167.

[2]Caronia LM,Phay JE,Shah MH,et al.Role of BRAF in thyroid oncogenesis[J].Clin Cancer Res,2011,17(24):7511-7517.

[3]Kim KH,Kang DW,Kim SH,et al.Mutations of the BRAF gene in papillary thyroid carcinoma in a Korean population[J].Yonsei Med J,2004,45(5):818–821.

[4]DeLellis RA,LLoyd R,Heitz PU.WHO classification of tumors,pathology and genetics-tumors of endocrine organs[J].IARC Press,Lyon,2004.

[5]徐瑋,李惠，孫怡，等.軟組織肉瘤中C-KIT,PDGFRα基因突變的檢測(cè)結(jié)果分析[J].海南醫(yī)學(xué),2013,23(24):3439-3442.

[6]Cantwell ER,O'Leary JJ,Sheils OM,et al.BRAFV600E:implications for carcinogenesis and molecular therapy[J].Mol Cancer Ther,2011,10(3):385-394.

[7]Sapio M R，Posca D，Troncone G，et a1.Detection of BRAF mutation in thyroid papillary carcinoma by mutant allele-specific PCR amplification(MASA)[J].EurJ Endocrinol，2006，154(2):341-348.

[8]Fukushima T,Takenoshita S.Roles of RAS and BRAF mutations in thyroid carcinogenesis[J].Fukushima J Med Sci,2005,51(2):67-75.

[9]Hwang J,Shin JH,Han BK,et al.Papillary thyroid carcinoma with BRAFV600E mutation:sonographic prediction[J].AJR Am J Roentgenol,2010,194(5):W425–430.

[10]Nikiforov YE,Nikiforova MN.Molecular genetics and diagnosis of thyroid cancer[J].Nat Rev Endocrinol,2011,7(10):569-580.

[11]Zhang B,Liu S,Zhang Z,et a1.Analysis of BRAF(V600E)mutation and DNA methylation improves the diagnostics of thyroid fine needle aspiration biopsies[J].Diagn Pathol,2014（9）:45.

[12]Guan H,Ji M,Bao R,et a1.Association of high iodine intake with the T1799A BRAF mutation in papillary thyroid cancer[J].J Clin Endocrinol Metab,2009,94(5):1612–1617.

[13]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et a1.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[14]Eloy C,Santos J,Soares P,et a1.The preeminence of growth pattern and invasiveness and the limited influence of BRAF and RAS mutations in the occurrence of papillary thyroid carcinoma lymph node metastases[J].Virchows Archiv,2011,459(3):265-276.

[15]Yong SK,Jeong SK,Ja SB,et a1.Clinical implication of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma[J].World J Surg Oncol,2013（11）:99.

[16]Xing M,Alzahrani AS,Carson KA,et a1.Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer[J].JAMA,2013,309(14):1493-1501.