林招賢 陳 新 吳榕龍 潘丹玲

1.福建省立醫(yī)院胸外科，福建福州 350001；2.福建省立醫(yī)院病理科，福建福州 350001

實體腫瘤的特征之一使缺氧，若缺氧狀態(tài)下惡性腫瘤仍能不斷浸潤、生長，說明癌組織對缺氧適應(yīng)能力很強，而這種能力主要由生成血管及增加糖酵解實現(xiàn)[1,2]。目前對癌組織長、浸潤的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織在缺氧狀態(tài)下的生長主要與COX-2、HIF-1α有關(guān)[3,4]。該研究中，隨機選取2011年5月—2013年5月在該院治療的56例肺癌患者的肺癌組織標(biāo)本進行病理檢查，應(yīng)用免疫組化法，對肺癌組織中的COX-2、HIF-1α的表達進行檢測，用CD34對腫瘤組織的微血管密度(microvessel density，MVD)進行檢測，探討COX-2、HIF-1α的表達及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集在該院治療的肺癌病人的組織標(biāo)本56例，經(jīng)病理實驗證實均屬肺癌組織。其中男39例，女17例；年齡47～81歲，平均(64.69±6.45)歲；小細胞癌18例，腺癌9例，鱗癌29例。根據(jù)美國聯(lián)合癌癥分類委員(AJCC)與國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002制訂的TNM分期標(biāo)準：Ib期 3例，IIb期 6例，IIIa期 14例，IIIb期 11例，IV期21例。早期(Ib期，IIIa期)26例，晚期(IIIb期，IV期)30例。

1.2 試劑

HIF-1α兔抗人多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），濃度 1：50。 COX-2、CD34、超敏 S-P 試劑盒為即用型（福州邁新生物技術(shù)工程公司）。

1.3 方法

步驟運用免疫組化法，步驟如下。①用10%福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋，將切片（4μm）用二甲苯脫蠟，用梯度乙醇進行水化；②用3%過氧化氫溶液在室溫下浸泡20 min，并用磷酸鹽溶液（PBS）沖洗2次；③將切片放入枸櫞酸溶液100℃水浴加熱15 min，待自然冷卻后用磷酸鹽溶液沖洗2次；④將山羊血清密封，37℃恒溫孵育20 min；⑤將血清棄去，分別滴加HIF-1α兔抗人多克隆抗體稀釋液以及COX-2、CD34，4℃恒溫孵育一夜，并用PBS沖洗2次；⑥滴加通用型IgG生物素化，在室溫下孵育30 min，并用PBS沖洗2次；⑦滴加比例適當(dāng)?shù)睦备笜?biāo)記鏈酶卵白素(經(jīng) PBS稀釋)，在室溫下孵育 30 min，用 PBS沖洗2次；⑧顯色，用蘇木素進行復(fù)染、脫水、透明、封片，并用顯微鏡進行觀察。

1.4 判定標(biāo)準

HIF-1α參照Bimer等[5]研究方法，細胞漿或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性，在400倍高倍鏡下每張切片隨機選取5個視野觀察，每個視野計數(shù)細胞200個，共計數(shù)1000個。根據(jù)染色強度及陽性細胞率半定量處理：染色強度評分標(biāo)準：1分：弱染色但較陰性對照強；2分：染色較強；3分：染色強；細胞陽性率評分標(biāo)準：2分：陽性率 11%～50%；3分：陽性率 51%～80%；4分：陽性率>81%。兩項評分結(jié)果相加，陽性率<10%者，均為陰性表達(-)；其余 3分弱陽性(+)；4～5分中度陽性(++)；6～7分強陽性(+++)。COX-2判定標(biāo)準如上。MVD參照Weidner[6]的報道方法，于40倍物鏡下尋找高密度血管區(qū)，在200倍高倍鏡下觀察3個視野內(nèi)被CD34染為棕色的血管數(shù)目，計算平均值。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSSl7.0軟件對研究數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采取χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 COX-2、HIF-1α在肺癌組織中的表達情況

COX-2主要在胞漿中表達，為棕黃色。56例肺癌組織中陽性表達為 44例（78.57%）；其中，弱陽性為 18例（40.91%）；中度表達為16例 (36.36%)；強表達 10例 (22.73%)。HIF-1α 主要在胞核或胞漿中表達，為棕黃色。56例肺癌組織中陽性表達為45（80.36%），其中，弱陽性為 17例（37.78%），中度表達為 13例（28.89%），強表達為 15例（33.33%）。

2.2 COX-2、HIF-1α陽性率與病理分型的關(guān)系

56例肺癌組織中COX-2陽性為44（78.57%），其中小細胞癌陽性表達率77.78%，腺癌陽性表達率88.89%，鱗癌陽性表達率75.86%。HIF-1α陽性率為45（80.36%），其中小細胞癌陽性表達率94.44%，腺癌陽性表達率77.78%，鱗癌陽性表達率為86.21%。COX-2、HIF-1α陽性率均不受病理分型影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 見表 1。

表1 COX-2、HIF-1α陽性率與病理分型關(guān)系[n（%）]

2.3 COX-2、HIF-1α陽性率與病理分期的關(guān)系

COX-2在早期肺癌組中陽性表達率為61.54%（16/26），晚期表達率為90.00%(27/30),COX-2與病理分型有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.839，P<0.05）；HIF-1α 在早期肺癌組中陽性表達率為80.77%（21/26），晚期為 93.33%（28/30），HIF-1α 與病理分型有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2==9.286，P<0.05）。 見表 2。

表2 COX-2、HIF-1α陽性率與病理分期的關(guān)系[n(%)]

2.4 COX-2陽性率與MVD的關(guān)系

COX-2弱陽性的 MVD值為（13.32±8.91），較強陽性為（19.20±9.98），（強陽性為 23.04±5.69），MVD 隨著 COX-2 表達強度增加而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 COX-2陽性率與MVD的關(guān)系（）

表3 COX-2陽性率與MVD的關(guān)系（）

表達狀態(tài)MVD值弱陽性較強陽性強陽性（n=18）（n=16）（n=10）13.32±8.9119.20±9.9823.04±5.69

2.5 HIF-1α陽性率與MVD的關(guān)系

HIF-1α 弱陽性 MVD 值為（13.78±4.59），較強陽性為（21.59±8.25），強陽性為（28.58±2.59），MVD 隨著 HIF-1α 表達強度增加而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4。

表4 HIF-1α陽性率與MVD的關(guān)系（）

表4 HIF-1α陽性率與MVD的關(guān)系（）

表達狀態(tài)MVD值弱陽性較強陽性強陽性（n=17）（n=13）（n=15）13.78±4.5921.59±8.2528.58±2.59

3 討論

由于癌組織在缺氧環(huán)境下亦能生長、浸潤，因此隨著對癌組織研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)COX-2與HIF-1α在癌組織中異常表達，Marxsen[7]對肺癌、皮膚癌、前列腺癌、乳腺癌等進行分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中HIF-1α呈過表達，特別是腫瘤壞死區(qū)域及腫瘤浸潤邊緣更加明顯，而腫瘤組織的基質(zhì)細胞及鄰近正常組織中未見HIF-1α表達。Shoslow等[8]采用免疫組化法對60例腫瘤組織的石蠟切片進行檢測，包括肺癌(腺癌、鱗癌)、乳腺癌、結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)COX-2在90%的肺癌、56%的乳腺癌、71%的結(jié)腸癌中顯示中度甚至高度表達。Tomozawa等[9]認為COX-2產(chǎn)生的血栓素、前列腺素是形成新血管的必要因素，它們能夠誘導(dǎo)VEGF生成，增使血管通透性增加，并增血流量，同時還可以抑制內(nèi)皮細胞的凋亡，從而促進血管的生成。

在該研究中證實COX-2和HIF-1α與癌組織病理分期具有重要關(guān)系，COX-2在早期肺癌組中陽性表達率為61.54%，晚期表達率為90.00%；HIF-1α在早期肺癌組中陽性表達率為80.77%，晚期為93.33%。而且MVD的強度COX-2和HIF-1α的陽性狀態(tài)的增強而增強。但研究發(fā)現(xiàn)COX-2和HIF-1α與癌組織的病理分型關(guān)系不大。由此可見COX-2和HIF-1α對于癌組織在缺氧狀態(tài)下血管的生成具有重要作用。而且對于新的有關(guān)影響癌組織血管生成的因素的研究也在繼續(xù)，在未來的抗腫瘤研究領(lǐng)域?qū)⒂懈嘤欣诎┌Y治療的方法出現(xiàn)。這就使得惡性腫瘤的治療希望越來越大。

綜上所述，對COX-2與HIF-1α的研究及其調(diào)控對于抑制腫瘤血管的生長方面擁有廣闊的前景及價值，在今后的抗腫瘤治療中勢必會成為新靶點。而COX-2與HIF-1α的相互影響及關(guān)系，也將成為治療腫瘤的有力依據(jù)。同時也替該院應(yīng)該繼續(xù)加大對其他有關(guān)其組織形成的基因的研究，以便于全面的綜合的對惡性腫瘤進行治療。

[1]連一新，施敏驊.缺氧誘導(dǎo)因子-1α和環(huán)氧化物酶-2在肺癌組織中的表達及其與血管生成的關(guān)系[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,5(12)：15-16.

[2]鄧述愷,聶文軍,王長安.HIF-1α和COX-2在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2010,5(13):27-28.

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[5]Bimer E，Schindl M，Obermair A，et a1.Over expression of hypoxia-inducible factor lalpha is a marker for an unfavorable prognosis in earlystage invasive cervical cancer[J].Cancer Res，2000，60(17)：4693-4699.

[6]Weidner N.In tratum or almicrovessel density as a prognostic factor in cancer[J].Am J Pathol，1995，147(1)：9-19.

[7]Marxsen JH，Schmitt O，Metzen E，et a1.Vascular endothelial Growthfactorgene expressionin the human breast cancer cell line MX21 iscontrolledby 02 availabilityin vitro and in vivo[J].AnnAnat，2001（183）：243-249.

[8]Shoslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.COX-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and Mammary tumors[J].Cancer，2000（89）：2637-2645.

[9]Tomozawa S，Tsuno NI-I，Sunaml E，et al.Cyclooxygenase-2over Expression correlates with tumor recurrence especially hematogenous metastasis of colorectal cancer[J].Br J Cancer，2000（61）：324-328.