肖光文，汪雪濤，喬亞峰，鄒尚平，葉振東

2.臨澧縣人民醫(yī)院檢驗科，常德 415200；

3.梅州市人民醫(yī)院檢驗科，梅州 514031；

Email：270591805＠qq.com

隨著抗菌藥物使用而出現(xiàn)的細(xì)菌耐藥性問題越來越嚴(yán)重，NDM－1超級細(xì)菌[1]越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。鮑曼不動桿菌作為構(gòu)成超級細(xì)菌的重要細(xì)菌之一，對其耐藥問題的研究越來越被臨床所重視。亞胺培南、美羅培南等碳?xì)涿瓜╊惪咕幬锸桥R床治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染療效最好的藥物之一。隨著該類藥物在臨床上的廣泛運用，近年來耐藥率有升高的趨勢。鑒于目前鮑曼不動桿菌的耐藥現(xiàn)狀，對梅州地區(qū)臨床分離的耐碳?xì)涿瓜╊愼U曼不動 桿 菌 （Carbapenem－resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB）的耐藥情況及耐藥機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 2012年1－12月從梅州地區(qū)1家三級醫(yī)院，4家二級醫(yī)院門診和住院病人的各類臨床標(biāo)本中分離無重復(fù)的鮑曼不動桿菌703株，其中CRAB 210株。

1.2 質(zhì)控菌株 大腸埃希氏菌（ATCC25922），銅綠假單胞菌（ATCC27853）。

1.3 主要儀器與試劑 基因擴(kuò)增儀、電泳儀為美國Bio－rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為法國VL公司產(chǎn)品；藥敏試驗用藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，MH培養(yǎng)基為杭州天和公司提供。DNA分子標(biāo)準(zhǔn)、PremiX Taq酶等PCR試劑購自日本TaKaPa公司。引物設(shè)計由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列分析由北京諾賽基因組研究中心完成。

1.4 藥敏試驗 按臨床微生物學(xué)操作規(guī)程對標(biāo)本進(jìn)行接種培養(yǎng)后，藥敏試驗采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，部分醫(yī)院采用自動化儀器進(jìn)行。實驗結(jié)果嚴(yán)格按照2010年版美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）判斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.5 耐碳?xì)涿瓜┍硇偷暮Y選 用改良的Hodge試驗檢測碳?xì)涿瓜┟?，根?jù)文獻(xiàn)[2]按照CLSI推薦方法進(jìn)行。將濃度為1.5×108CFU／mL的大腸埃希菌ATCC25922按照10倍稀釋后涂布于M－H平板，中央貼上亞胺培南（10μg）藥敏紙片，接種環(huán)調(diào)取待檢菌自紙片外緣向平板邊緣劃線接種，過程中注意勿劃破平板。35。C培養(yǎng)18h，亞胺培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長現(xiàn)象的為產(chǎn)碳?xì)涿瓜┟妇辍?/p>

1.6 用PCR法分析主要碳?xì)涿瓜┟富?煮沸法提取細(xì)菌DNA：將培養(yǎng)18h的待檢菌單個菌落于500μL TE buffer中，沸水浴10min，10 000r／min離心5min，取2μL上清作DNA模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系共50μL，其中每條引物1 μL，MgCl25μL，dNTP 4μL，Tag酶0.5μL，模板2 μL，H2O 37μL。反應(yīng)條件為：94。C預(yù)變性5min；94。C變性1min，55。C退火1min，72。C延伸1min，30個循環(huán)；72。C延伸10min。檢測不同類型的碳?xì)涿瓜┗虻姆磻?yīng)條件可能不同，以文獻(xiàn)報道為參考。所用引物見表1。PCR產(chǎn)物在含有EB為1.5%的瓊脂糖凝膠上100V恒壓電泳50min后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后在GenBank進(jìn)行同源查詢工具分析。

表1 碳?xì)涿瓜┟富騊CR引物序列及擴(kuò)增片段長度Tab.1 Primer sequences for PCR and expected product size of carbapenemase

1.7 采用重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（ERIC－PCR）分析同源性 引物設(shè)計為 ERIC－F，5′－3′：ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC，ERIC－R，5′ － 3′：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。ERIC－PCR體系的組成和反應(yīng)條件：總反應(yīng)體系為50μL，dNTP 4μL，模板DNA 2μL，Tap酶0.25μL，10×緩沖液 5μL，ERIC－F 1μL，ERIC－R 1μL，H2O 36.75μL；預(yù)變性95。C5min，循環(huán)變性95。C45s，退火42。C30s，延伸72。C1min，40個循環(huán)后，72。C延伸10min。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并判斷同源性。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性試驗結(jié)果210株CRAB對抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表2。

表2 210株CRAB對抗菌藥物的敏感率（%）Tab.2 Drug susceptibility rates of 210strains of CRAB（%）

2.2 碳?xì)涿瓜┟副硇秃Y選結(jié)果 在CRAB的210菌株中，采用改良Hodge試驗得到陽性菌株163株（77.62%），陰性菌株47株（22.38%）。在163株陽性菌株中，同時對美羅培南和亞胺培南耐藥的為158株，僅對美羅培南耐藥的為2株，僅對亞胺培南耐藥的為3株。

圖1 CRAB的改良Hodge試驗結(jié)果Fig.1 Results of modified Hodge test of CRAB

2.3 用PCR法分析主要碳?xì)涿瓜┗蚪Y(jié)果 210個菌株中，Bla－OXA－51的檢出率為最高為94.29%（198／210），其中碳?xì)涿瓜┟副硇完栃?63株菌株全部檢出Bla－OXA－51。Bla－OXA－23的檢出率次之為78.57%（165／210），其中碳?xì)涿瓜┟副硇完栃跃暧?58株檢出 Bla－OXA－23，另外7株 Bla－OXA－23檢出菌株為表型陰性。Bla－VIM的檢出率為4.29%（9／210），全部為碳?xì)涿瓜┟副硇完栃?。Bla－IMP、Bla－OXA－24、Bla－OXA－58均未被檢出。BLAST 分析結(jié)果顯示：Bla－OXA－23擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表面序列長度為502bp，經(jīng)比對其序列符合率為99.9%；Bla－VIM擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表面序列長度為756bp，經(jīng)比對其序列符合率為99.6%；Bla－OXA－51擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表面序列長度為359bp，經(jīng)比對其序列符合率為99.8%。（見圖2）

圖2 部分 Bla－OXA－23、Bla－VIM、Bla－OXA－51PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Representative PCR electropherogram of Bla－OXA－23，Bla－VIM and Bla－OXA－51

2.4 ERIC－PCR分析同源性結(jié)果 210株CRAB ERIC－PCR分型結(jié)果顯示，主要有7個型別，其中A型97株，A1型53株，A2型44株；B型44株，B1型40株，B2型20株；其他為C型6株，D型7株，E型9株，F(xiàn)型6株，H型25株。（見圖3）

圖3 部分CRAB的ERIC－PCR結(jié)果Fig.3 ERIC－PCR result of parts of the CRAB

3 討 論

近年來，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛運用，對其耐藥的細(xì)菌越來越多，且往往對臨床很多常用抗菌藥物也耐藥而成為泛耐藥株，鮑曼不動桿菌就是這些細(xì)菌的典型代表之一。這種耐藥往往導(dǎo)致臨床患者住院時間的延長而加重患者的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)，甚至嚴(yán)重的可引起患者的死亡[3]。本研究對梅州地區(qū)臨床CRAB對常規(guī)藥物的研究表明：CRAB對常規(guī)藥物除多粘菌素B外，對其他的抗菌藥物的耐藥率都在60%以上。其中對頭孢哌酮／舒巴坦和多西環(huán)素的耐藥率在60%左右外，其余14種耐藥率都超過了80%，磺胺甲噁唑甚至是100%耐藥。這比2010年中國CHINET對臨床分離的鮑曼不動桿菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)[4]明顯增高。說明鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥容易出現(xiàn)多重耐藥甚至泛耐藥。近年來，多粘菌素B治療多重耐藥，特別是對鮑曼不動桿菌取得了較好的療效，引起了臨床的關(guān)注。本研究表明多粘菌素B對CRAB敏感率達(dá)到99.52%，可以作為本地區(qū)治療CRAB的重要藥物。

目前，多重耐藥鮑曼不動桿菌主要的耐藥機(jī)制有：產(chǎn)生碳?xì)涿瓜┟?，藥物主要外排系統(tǒng)的過度表達(dá)，外膜孔蛋白的改變及與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的親和力下降等[5]。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生往往是一種或幾種機(jī)制共同作用所致[6]，CRAB的耐藥機(jī)制尤以質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的各類碳?xì)涿瓜┟该黠@重要。本研究中，163株（77.62%）的菌株采用改良的Hodge試驗呈陽性結(jié)果，說明這些菌株可以產(chǎn)生碳?xì)涿瓜┟?。?7株（22.38%）呈現(xiàn)陰性，但基因檢測有 檢 出 Bla－OXA－51 及 Bla－OXA－23，提 示 改 良Hodge試驗檢測碳?xì)涿瓜┟赣新z現(xiàn)象，這可能是不同菌株產(chǎn)生碳?xì)涿瓜┟笇μ记嗝瓜╊惪股厮饽芰Φ牟町悓?dǎo)致出現(xiàn)的矢狀生長區(qū)域大小不同。這與雷紅等[7]報道的改良Hodge試驗（亞胺培南紙片法）陽性率為66.7%接近。

碳?xì)涿瓜┟钢饕蠥、B、D 3類β內(nèi)酰胺酶，其中A和D類均為絲氨酸酶，前者主要存在于腸桿菌科細(xì)菌中，鮑曼不動桿菌主要見于后者。D類β內(nèi)酰胺酶即OXA酶，可以滅活碳青霉烯類抗生素，不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的主要有 OXA－21、OXA－23～OXA－27、OXA－40、OXA－58 等[8]，可 分 為 4 組，分 別 以O(shè)XA－23、OXA－24、OXA－51、OXA－58為代表。B類為金屬β內(nèi)酰胺酶目前檢出率低于OXA酶，但對碳?xì)涿瓜╊惪股氐乃饣钚允瞧?0～1 000倍[9]，主要有IMP型、VIM 型和SIM 型，不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的主要為IMP型和VIM型。所以本研究選取了 OXA－23、OXA－24、OXA－51、OXA－58、IMP和VIM 6個基因進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，Bla－OXA－51檢出率最高為 94.29%，其次為 Bla－OXA－23 為78.57%，Bla－VIM 的 檢 出 率 為 4.29%，Bla－IMP、Bla－OXA－24、Bla－OXA－58均未被檢出。提示梅州地區(qū)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥主要由OXA－51型和OXA－23型酶引起，這與國內(nèi)梁偉[2]的報道是一致的，而低于孫立穎[10]的報道。Bla－VIM的檢出率為4.29%，說明梅州地區(qū)2012年出現(xiàn)了產(chǎn)VIM型金屬β內(nèi)酰胺酶型鮑曼不動桿菌的感染，經(jīng)追查為同一家醫(yī)院的住院病人，據(jù)此我們可以推斷有可能來自同一耐藥菌株的克隆傳播。

對耐藥菌株進(jìn)行基因同源性分析，從流行病學(xué)角度對有效抑制耐藥菌株的擴(kuò)散具有重要的意義。本研究對210株CRAB進(jìn)行ERIC－PCR分型發(fā)現(xiàn)，主要有7種基因型，流行株以A型、B型和H型為主，其他型為散發(fā)流行。A型、B型一直是臨床上比較常見的基因型[11]，在本地區(qū)各醫(yī)院都有分布。對H型的追蹤發(fā)現(xiàn)，主要出現(xiàn)在3～5月份一家醫(yī)院的ICU 科，且全部為 Bla－OXA－51、Bla－OXA－23陽性，說明該院在3～5月ICU科暴發(fā)了H型株的流行。當(dāng)發(fā)暴發(fā)流行后，立即啟動了緊急措施進(jìn)行了有效控制，隨后幾個月的監(jiān)測表明該次暴發(fā)得到了有效的控制。

綜上所述，梅州地區(qū)CRAB對臨床常用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，OXA型碳?xì)涿瓜┟甘潜镜貐^(qū)耐藥的重要機(jī)制，并伴隨也克隆株的流行。所以，對本地區(qū)醫(yī)院CRAB監(jiān)測，預(yù)防其暴發(fā)流行已經(jīng)刻不容緩。

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