于晶峰，譚 偉，李 濱，劉曉松，常建華，楊曉野，王 瑞，楊蓮茹，李秀霞

2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，呼和浩特 010031；

3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110

細(xì)粒棘球蚴病，又名包蟲(chóng)病，是世界廣泛分布的人獸共患性寄生蟲(chóng)病[1－2]，對(duì)感染動(dòng)物的肉產(chǎn)量、肉品質(zhì)、產(chǎn)奶量及后代繁殖均有嚴(yán)重影響[3]，更重要的是該病對(duì)人類的健康也構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[4－7]，因此一直倍受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近年來(lái)，相關(guān)學(xué)者已在基因水平上對(duì)細(xì)粒棘球蚴的蟲(chóng)株的遺傳變異進(jìn)行了研究。

據(jù)報(bào)道，蟲(chóng)株的遺傳變異可能會(huì)影響到生理周期模式、宿主的特異性、感染性、抗原性、傳播動(dòng)力學(xué)、治療藥物的敏感性、致病性、診斷結(jié)果、流行病學(xué)和防控措施[8]。因此，確定蟲(chóng)株對(duì)制定棘球蚴病的預(yù)防和控制策略具有十分重要的意義。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株的鑒定比較復(fù)雜，以往主要是以其成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合生物學(xué)、生物化學(xué)、同工酶分析和流行病學(xué)等方面的資料，作為蟲(chóng)株鑒別的依據(jù)。雖然形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征可為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株鑒定提供很有價(jià)值的資料，但是由于受宿主和環(huán)境多種因素的影響，并不能反映不同蟲(chóng)株之間基因水平上的差異。近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地促進(jìn)了人們對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株基因型鑒定的研究。眾所周知，線粒體DNA（mtDNA）具有進(jìn)化率快、重組率低、獨(dú)立進(jìn)化和基因組精簡(jiǎn)等特點(diǎn)[9－10]，可作為重要的分子標(biāo)記，用于生物種群的遺傳變異研究，尤其適于種以下水平的分類研究[11]。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的線粒體基因組共編碼2個(gè)核糖體RNA（12S、16S）、22 個(gè) tRNA、1 個(gè) 細(xì) 胞 色 素 b（Cytb）、3 個(gè) 細(xì) 胞 色 素 氧 化 酶 亞 基 （CO1、CO2、CO3）、NADH氧化還原酶6個(gè)亞基的基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND6）和 ATP酶一個(gè)亞基的基因（ATPase6）[12]。其中編碼呼吸鏈的細(xì)胞色素c氧化酶和NADH氧化還原酶普遍存在于原核生物和真核生物細(xì)胞的線粒體中，是線粒體基因組中進(jìn)化速率較慢的，可用以比較其在進(jìn)化上的相互關(guān)系[13]。

鑒于以上因素，本研究以內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏旗地區(qū)檢獲的羊株和錫林浩特市地區(qū)檢獲的人株細(xì)粒棘球蚴作為研究對(duì)象，對(duì)其CO1與ND1基因的部分序列分別進(jìn)行分析，并將兩種序列與Gen－Bank中已報(bào)道的細(xì)粒棘球蚴CO1和ND1基因相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，目的在于明確這些地區(qū)不同動(dòng)物宿主間細(xì)粒棘球蚴種株的基因型和遺傳變異情況及不同地理株之間的基因差異，這對(duì)了解家畜和人細(xì)粒棘球蚴病的感染來(lái)源以及不同宿主間的傳播鏈并制定不同地區(qū)細(xì)粒棘球蚴病的具體防控措施，具有重要參考意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 細(xì)粒棘球蚴包囊采自于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏旗綿羊和錫林浩特市某醫(yī)院細(xì)粒棘球蚴病患者。將采集的樣本用注射器將囊液吸出，離心1min使囊液與原頭蚴分離，－20。C條件下保存。

1.1.2 菌種、載體及主要試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA提取試劑盒（DNeasy Blood ＆Tissue Kit）和DNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit），購(gòu)自北京市天根生化科技有限公司；Premix Taq、pMD19－T 載體、DL2000DNA Marker、氨芐青霉素（Amp）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半 乳 糖 苷 （X－gal）、異 丙 基－β－D－硫 代 半 乳 糖 苷（IPTG）、10×Loading Buffer，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；核酸染料，購(gòu)自北京市賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)粒棘球蚴原頭蚴，按照動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取基因組DNA，并置于－20。C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CO1與ND1基因擴(kuò)增 以細(xì)粒棘球蚴DNA 為 模 板，用 上 游 引 物 5′－TTGTTAGGTGGTTTGTCTGA－3′和下游引物5′－GGCCATCATCAAATAAACAT－3′，擴(kuò)增 CO1 基因部 分 序 列，PCR反應(yīng)體系為50μL，內(nèi)含Permix Taq 25μL，上下游引物各1.5μL，模板5μL，加dH2O補(bǔ)足至50 μL。同時(shí)，設(shè)置不加DNA模板的陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件為：94。C預(yù)變性5min后，進(jìn)入循環(huán)；即95。C變性1min，45。C退火45s，72。C延伸70s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。

同樣以細(xì)粒棘球蚴DNA為模板，用上游引物5′－GGTGGTTGTTTTTGGGTTAG－3′和下游引物5′－GTTTGCTATTGTTAATTAA－3′，擴(kuò) 增 ND1基因部分序列。PCR反應(yīng)體系為同上，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。PCR條件為：94。C預(yù)變性5min，95。C變性1min，50。C退火50s，72。C延伸70s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后以72。C繼續(xù)延伸10min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆與測(cè)序 利用膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的片段進(jìn)行膠回收，將回收的CO1基因與ND1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pMD19－T載體連接。然后，將鏈接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，再分別涂布于LB固體培養(yǎng)基（含有 Amp、IPTG、X－gal）表面，37。C恒溫培養(yǎng)12h～16h，后置4。C冰箱顯色1h～2h。挑取數(shù)個(gè)白色菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37。C、180r／min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，菌液經(jīng)PCR鑒定后，將陽(yáng)性菌液送至中美泰和公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 CO1與ND1基因PCR擴(kuò)增 細(xì)粒棘球蚴CO1和ND1基因分別經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，在約936bp、895bp處呈現(xiàn)特異性條帶，與目的片段大小基本一致，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 細(xì)粒棘球蚴CO1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of CO1gene fromEchinococcus granulosus

圖2 細(xì)粒棘球蚴ND1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of ND1 gene fromEchinococcus granulosus

2.2 CO1與ND1基因測(cè)序結(jié)果 西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴CO1基因與錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴CO1基因片段大小均為936bp，其A、T、G、C含量分別為15.71%、24.89%、48.72%、10.68%和15.60%、25.11%、47.54%、11.75%。

西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴ND1基因與錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴ND1基因片段大小均為895bp其 A、T、G、C 含量分別為 19.44%、25.92%、46.59%、8.04% 和 19.44%、25.92%、46.82%、7.82%。

2.3 CO1基因序列比對(duì)結(jié)果 比對(duì)結(jié)果顯示：西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴CO1基因與錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴CO1基因分別同GenBank中已登錄的新疆羊株細(xì)粒棘球蚴的CO1基因序列相比，相應(yīng)區(qū)域同源性分別存在6個(gè)和13個(gè)變異位點(diǎn)，突變類型均為轉(zhuǎn)換，即G與A置換和T與C置換；同源性分別為99.3%、98.6%（圖3）。

圖3 不同地理樣本間CO1基因序列同源性比較Fig.3 Homology of CO1gene sequences from different areas

2.4 ND1序列比對(duì)結(jié)果 利用DNAStar5.0中的MegAlign工具對(duì)ND1基因的序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴的ND1基因序列與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的G1型ND1基因序列完全相同；錫林浩特人株細(xì)粒棘球蚴的ND1基因序列與G1型ND1基因序列存在2個(gè)變異位點(diǎn)，全部為T(mén)與C轉(zhuǎn)換；西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴和錫林浩特人株細(xì)粒棘球蚴均為G1基因型。

3 討 論

現(xiàn)有研究表明，動(dòng)物mtDNA按照嚴(yán)格的母性遺傳方式傳代，分子量小，拷貝數(shù)多，基因的堿基替代率比單拷貝的核DNA基因組快5～10倍，進(jìn)化速率很快，其中CO1基因和ND1基因相當(dāng)保守，表現(xiàn)為不同程度的種內(nèi)遺傳差異和種間差異。因此，CO1基因和ND1基因可用于動(dòng)物性寄生蟲(chóng)的鑒 定 和 不 同 地 理 株 的 區(qū) 分[14－15]。 李 明 偉 等（2005）[16]對(duì)犬弓首蛔蟲(chóng)的CO1基因部分序列進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果表明不同地方蟲(chóng)株的CO1基因表現(xiàn)出一定的差異性。劉國(guó)華等（2009）用不同地區(qū)的泡狀帶絳蟲(chóng)的CO1基因序列與GenBank中報(bào)道的泡狀帶絳蟲(chóng)的CO1基因序列進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者CO1基因序列無(wú)差異[17]。本研究對(duì)西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴和錫林浩特人株細(xì)粒棘球蚴CO1基因進(jìn)行了測(cè)序，并將兩株細(xì)粒棘球蚴CO1基因與新疆株細(xì)粒棘球蚴的CO1基因進(jìn)行了比較。從序列對(duì)比結(jié)果可看出，西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴和錫林浩特人株細(xì)粒棘球蚴的CO1基因與新疆株細(xì)粒棘球蚴的CO1基因同源性很高，分別為99.3%、98.6%。

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)對(duì)中間宿主有廣泛的適應(yīng)性，但在長(zhǎng)期進(jìn)化演變的過(guò)程中，蟲(chóng)體與宿主之間在相互適應(yīng)中也發(fā)生著變異。以往以形態(tài)學(xué)特征為主的蟲(chóng)株鑒定依據(jù)受到多種因素（如宿主和環(huán)境）的影響，并不能完全反映其基因水平的差異；而基于DNA序列的分析可直接鑒定生物體的不同種、亞種及地理株，能避免宿主和環(huán)境等因素的影響[18]，ND基因是常用的分型基因。國(guó)內(nèi)外學(xué)者根據(jù)基因型的差異，將細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)分為10個(gè)基因型，即G1～G10。不同基因型蟲(chóng)株對(duì)人的感染性和致病性有差別，G1、G2、G3、G5、G6、G7、G8、G9均可感染人，其他基因型蟲(chóng)株對(duì)人的致病性有待進(jìn)一步研究。不同基因型蟲(chóng)株間的核苷酸都有不同程度的差異，如G2和G3與G1間的核苷酸差異很小，被稱為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的狹義種；G4與其它蟲(chóng)株間的核苷酸差異在10%，G5與其它蟲(chóng)株間的核苷酸差異在6%以上；G6、G7、G8、G9、G10與 G1間的核苷酸差異超過(guò)10%。楊俊克（2004）[19]對(duì)我國(guó)三省區(qū)（青海省、甘肅省和新疆維吾爾族自治區(qū)）細(xì)粒棘球蚴基因變異的情況進(jìn)行了分析，由檢測(cè)結(jié)果可知，各地區(qū)分離株ND1基因的變異率為0.1%～0.7%，均屬于G1基因型。本研究對(duì)內(nèi)蒙古兩地區(qū)的細(xì)粒棘球蚴蟲(chóng)株進(jìn)行了測(cè)序，經(jīng)DNAStar5.0軟件分析可知，兩地區(qū)細(xì)粒棘球蚴均為G1型，以上數(shù)據(jù)表明，這些地區(qū)人的細(xì)粒棘區(qū)病有可能通過(guò)綿羊—犬—人方式進(jìn)行傳播流行，需要加以注意和防控。

綜上所述，本次研究所得的西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴和錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴的CO1基因與新疆株細(xì)粒棘球蚴的CO1基因相比均有變異位點(diǎn)，突變類型為轉(zhuǎn)換，即不同地理株細(xì)粒棘球蚴CO1基因的部分序列略有不同；但在ND1基因方面，與新疆株相比，西烏旗羊株細(xì)粒棘球蚴ND1基因序列無(wú)變異位點(diǎn)，而錫林浩特市人株細(xì)粒棘球蚴ND1基因序列存在2個(gè)變異位點(diǎn)，全部為T(mén)與C轉(zhuǎn)換。上述研究結(jié)果，為確定細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在內(nèi)蒙古某些地區(qū)的流行蟲(chóng)株基因型及其可能的傳播鏈情況提供了重要依據(jù)。

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