李 立，婁忠子，閆鴻斌，范彥雷，李建秋，殷 宏，賈萬忠

棘球蚴病(包蟲病)是由隸屬于扁形動物門(Platyhelminthes)絳蟲綱(Cestoda)帶科(Taeniidae)棘球屬(Echinococcus)絳蟲的中絳期或幼蟲寄生于動物和人的肝、肺等臟器所引起，是一種嚴重危害人和動物健康的人獸共患寄生蟲病，呈全球性分布，而我國是該病的高發(fā)區(qū)[1-2]。盡管早在公元前古希臘醫(yī)生希波克拉底(Hippocrates)、阿雷提烏斯(Aretaeus)和伽林(Galen)等就認識到人的這種疾病，但棘球蚴病的病原體，即棘球屬絳蟲的確定及分類是近幾個世紀完成的，研究人員對棘球屬絳蟲內種的成員已經基本澄清，對其研究歷經了早期對蟲體的描述即形態(tài)學方面的觀察和分類，之后蟲種和蟲株的識別以及近期現(xiàn)代分子生物學的研究[4-6]。

近年來，以自動化脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)測序技術和統(tǒng)計計算機算法為基礎的生物信息學取得的飛速發(fā)展，從根本上改變了對生物體如何進行分類，影響著如何能夠重建較高級分類單元到種和居群的進化關系[7-8]。隨著對棘球屬絳蟲分子生物學研究的深入，逐漸加深了人們對其種群多樣性的認識和理解，最終取得了棘球屬絳蟲種階元及種系發(fā)生關系的一致性認識。鑒于棘球屬內含有形態(tài)學上不易區(qū)分的隱藏種的存在，分子生物學技術對鑒定蟲種必不可少。因此，本文作者將從系統(tǒng)發(fā)生種概念這一角度入手，對棘球屬絳蟲9個有效種的確立及其分子種系發(fā)生研究方面所取得的重要進展進行綜述。

1 種系發(fā)生概念

種系發(fā)生也被稱作系統(tǒng)發(fā)生，是指在地球歷史發(fā)展過程中生物種系的發(fā)生和發(fā)展。通過形態(tài)學、解剖學、生理學特征以及DNA序列等數(shù)據(jù)特征，為生物建立一棵種系發(fā)生樹(演化樹)，以描述各個物種之間可能有的親緣關系。其中以分子數(shù)據(jù)為基礎的種系發(fā)生稱為分子種系發(fā)生(Molecular phylogeny)。由于種系發(fā)生的進化過程是不能被直接通過觀察和實驗所證實的，所以需要將各個方面的證據(jù)都綜合起來分析。此外，由于針對這些證據(jù)的側重點不同，經常會產生不同的演化(進化)樹版本。物種簡稱“種”，是生物分類的基本單位，關于物種的定義有多種，其中較為常用的物種概念有兩種——系統(tǒng)發(fā)生(物)種概念(Phylogenetic species concept, PSC)和生物種概念(Biological species concept)。系統(tǒng)發(fā)生種(Phylogenetic species，系統(tǒng)發(fā)育種，又譯為分支物種概念或者進化物種概念)被定義為最小集物種，是不可再分的(基本的)一群生物，與其他這樣的生物群可明確鑒別，群內成員來自共同祖先。而與此相對應的另一物種概念——生物學種(Biological species)概念由邁爾[9]提出，他認為物種實際上是彼此已進行雜交或彼此可能雜交的一組自然群體，它們跟其它這類群體在生殖上是隔離的。這個定義假設只適用于進行有性生殖的物種，定義生物學種的關鍵在于兩個種群間沒有顯著的基因物質交流。以單系群(Monophyly)為基礎的系統(tǒng)發(fā)生種概念要比生物學種概念靈活，這個觀念不需要考慮到生物的性別，而是以找尋個體的共同祖先為原則，允許親緣關系近的種之間可能雜交[10]。鑒于棘球屬絳蟲獨特的繁殖方式，即成蟲階段行自體交配和幼蟲階段行無性繁殖，因而本文將主要針對種系發(fā)生物種概念來對棘球屬絳蟲分類學進行論述。

2 棘球屬的一般特征與種的鑒定

2.1棘球屬絳蟲一般特征 棘球絳蟲生活史中蟲體發(fā)育要經歷兩個重要階段：成蟲期和中絳期(幼蟲期、蚴期)。棘球絳蟲成蟲為小型蟲體，一般由頭節(jié)、頸節(jié)和3～5個體節(jié)組成，體長不超過1 cm，這在帶科絳蟲很特別，而其它帶科絳蟲多為大型絳蟲，體節(jié)數(shù)成百上千，體長可超過1 mm。棘球絳蟲中絳期為包囊形式，包囊有3種類型包括單囊型(如細粒棘球絳蟲)、多囊型(如伏氏棘球絳蟲)和多房型(泡球型，只有多房棘球絳蟲)[11-12]，雖然這些包囊形態(tài)不同，但均具有相同的包囊結構。食肉動物和被獵食的哺乳動物是維持棘球絳蟲生活史所不可或缺的兩類宿主，成蟲寄生于食肉動物而中絳期寄生于草食動物、雜食動物包括人等。

2.2棘球屬絳蟲蟲株及基因型 由于棘球屬絳蟲尤其是細粒棘球絳蟲種內變異現(xiàn)象非常普遍，因此同種異名或者不同種同名現(xiàn)象時有發(fā)生，報道中常引入亞種、蟲株或者基因型等概念。但是，這些報道中的不少亞種其獨立性不能成立。雖然蟲株概念不是寄生蟲分類學上的正式階元，但是它在人們的實踐活動中被廣泛地接受和使用。后來的研究也表明，細粒棘球絳蟲蟲株在不同的地理環(huán)境和宿主中，存在著實質性的基因遺傳多樣性差異，其基因型與原來各蟲株間保持著相互對應的關系，且兩者之間極為一致。不同蟲株(基因型)在幼蟲(包囊)形態(tài)、對人和動物的致病性、宿主范圍、流行病學意義等方面存在差異(見表1)，對疫苗、診斷試劑及抗蟲藥物的研制和開發(fā)具有重要意義[13]。目前，業(yè)已發(fā)現(xiàn)的基因型或者蟲株(Strains)至少有10個(G1-G10)[14-18]，這些蟲株以它們所寄生的中間宿主的名稱進行命名。此外，廣義的細粒棘球絳蟲還包括獅株(Lion strain)[19-20]，但它是以終末宿主的名字進行命名的。在細粒棘球絳蟲廣義種內，其中的一部分蟲株(基因型)可以升格或者重新修正為單一種。因此，根據(jù)最新研究結果認為，棘球屬絳蟲至少包括9個有效種，每一個種都有著不同的宿主—寄生蟲相互關系(見表1)。

2.3種的識別和鑒定

直到現(xiàn)在，關于棘球屬的分類仍有爭議，這主要是由于蟲體的形態(tài)具有可塑性。其次，當蟲體寄生于異常宿主時使得人們對病原體的鑒定更為困難。歷史上，曾經將棘球屬模式種——細粒棘球絳蟲認為是囊性棘球蚴病和泡型棘球蚴病的病原體。雖然每一個種都有著不盡相同的宿主和寄生蟲關系，但是它們之間無論在地理分布還是形態(tài)學等方面有交叉和重疊現(xiàn)象，這給種的準確識別造成了困難。因而，種的確切鑒定還需要其它方法和手段。

二十世紀九十年代，隨著澳大利亞一研究小組應用分子分類學分析方法才使人們對棘球絳蟲的分類和鑒定有了大的突破。研究人員通過對分離株樣品線粒體細胞色素c氧化酶亞基1(Cytochromecoxidase subunit 1,cox1)和NADH脫氫酶亞基1(NADH dehydrogenase subunit 1,nad1)的基因片段的序列測定和分析，利用分子遺傳標記特征成功將細粒棘球絳蟲不同蟲株進行了基因分型，澄清了不同蟲株與基因型之間的確切關系，并且確定了棘球絳蟲不同種之間的差異[35]。隨后，更多的基因序列被用于棘球絳蟲蟲種鑒定與分子進化關系分析，使種的識別成為現(xiàn)實，種水平上的分類成為可能。通過這些基因片段序列數(shù)據(jù)可成功將細粒棘球絳蟲G1-G3型定名為狹義種，G4定名為馬棘球絳蟲，G5定名為奧氏棘球絳蟲，G6-G10定名為加拿大棘球絳蟲。大約在同一時期，科學家們在我國青藏高原發(fā)現(xiàn)了石渠棘球絳蟲，獅株被定名為獅棘球絳蟲，加之之前已定名的3種棘球絳蟲，共確立了棘球屬絳蟲9個種的分類地位。

表1 棘球絳蟲9個有效種流行病學主要特征之間的比較

表1續(xù)

種名Species蟲株/基因型Genotype中間宿主Intermediate host終末宿主Final host地理分布Distribution人的病例Human Infection參考文獻References鹿株(G10)(Fennoscandian cervid strain)駝鹿(Moose)、馴鹿(Rein-deer)、馬鹿(Red deer)狼(Wolf)、犬(Canine)加拿大 (Canada)偶見(Rare)[29]獅棘球絳蟲(E. felidis)獅株(Lion strain)未知 (Un-known)獅 (Lion)非洲 (Africa)未報道(Not repor-ted yet)[30]多房棘球絳蟲(E.multilocu-laris)分離株變異及種內變異較小,可分成歐洲、亞洲和美洲進化支(Ge-netic variation of isolates and intraspecific variation within species being small; divided into different clades: Europe-an clade, Asian clade and A-merican clade )小型哺乳動物(Small mam-mal)、家豬(Pig)、野豬(Wild boar)、猴(Monkey)、犬(Canine)狐貍(Fox)、犬(Canine)、貓(Cat)、狼(Wolf)、貉(Racoon dog)、土狼(效狼,Hyena)北半球 (The Northern Hemi-sphere)常見(Common)[31]石渠棘球絳蟲(E. shiquicus)未見報道 (Not reported yet)高原鼠兔(Plateau pi-ka)、田鼠(Hedgeshrew)藏狐(Tibetan fox)、犬(ca-nine) 中國青藏高原(Qinghai and Tibet Plateau, China)未報道(Not reported yet)[32]福氏棘球絳蟲(E. vogeli)未見報道(Not reported yet)小型哺乳動物(Small mam-mals)、天竺鼠(Cavia porcel-lus)、刺鼠(Agouti)、松鼠(Aquirrel)叢林犬(藪犬,Bush dog)、家犬(Domestic dog)新熱帶區(qū) (Neotropical region)偶見(Rare)[33]少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthra)未見報道(Not reported yet)小型哺乳動物(Small mam-mals)、天竺鼠 (Cavia porcel-lus)、刺鼠(Agouti)野生貓科動物(The wild fe-lines)、美洲虎(Jaguar)、美洲豹(Leop-ard)、美洲獅(Cougar)、美洲山貓(Bob-cat)新熱帶區(qū)(Neotropical region)偶見(Rare)[34]

3 種系發(fā)生關系

DNA序列信息已成為種系發(fā)生分析的先決條件，其中線粒體DNA序列由于受到線粒體內氧化環(huán)境的影響而容易發(fā)生突變，因此其進化速率快，在構建親緣關系相近物種的進化樹時比使用核DNA序列更有優(yōu)勢[36]。大量線粒體基因(組)序列信息已經為提高種系進化樹的分辨率積累了重要信息(見表2)。棘球屬絳蟲線粒體基因組核苷酸序列差異性比較結果見表3。

表2 棘球屬絳蟲線粒體基因組信息匯總

注：*cox1基因3′末端注釋有疑問。

Note: *The annotation of 3′ end ofcox1 gene is in doubt.

4 種系進化史

棘球絳蟲具有獨特的繁殖方式：成蟲為雌雄同體，以自體受精為主；中絳期(幼蟲或者蚴)行無性繁殖。棘球絳蟲這種繁殖形式造就了它的生物多樣性，這種雙向發(fā)育和繁殖模式加速了遺傳一致性種群的形成[6]。一個突變體變?yōu)橐豢寺》N群的趨勢將

表3 棘球屬絳蟲線粒體蛋白編碼基因核苷酸序列差異比較

影響棘球絳蟲種的形成。因此，棘球絳蟲成功自適應突變體所需宿主在兩個發(fā)育階段——成蟲和幼蟲間的切換可能會出現(xiàn)，而宿主可能對變異體的成功形成起到適應性選擇作用。

根據(jù)線粒體基因組12個蛋白編碼基因核苷酸序列第1位和第2位堿基構建的棘球屬絳蟲分子進化樹見圖1(根據(jù)線粒體12個蛋白編碼基因核苷酸序列用MEGA5軟件的鄰接法繪制)，其拓撲結構與Nakao等人構建的系統(tǒng)發(fā)生圖相似[6]。

圖1 棘球屬絳蟲分子種系發(fā)生樹

分子進化樹顯示：(1)E.oligarthra和E.vogeli位于進化樹基部，這兩種棘球絳蟲分布于新熱帶區(qū)(Neotropical region)；(2)少節(jié)棘球絳蟲與棘球屬其它成員呈姊妹關系；(3)多房棘球絳蟲與石渠棘球絳蟲之間，細粒棘球絳蟲狹義種和獅棘球絳蟲之間，奧氏絳蟲和加拿大絳蟲之間分別呈姊妹關系；(4)馬棘球絳蟲與加拿大棘球絳蟲、奧氏棘球絳蟲、多房棘球絳蟲及石渠棘球絳蟲形成一進化支；(5)加拿大棘球絳蟲G6-G10基因型之間親緣關系密切；(6)多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲組成的節(jié)點與細粒棘球絳蟲G4-G10基因型組成的節(jié)點之間的自展檢驗值比較低。

當然，只用線粒體基因組數(shù)據(jù)構建分子進化樹也存在對真正進化史誤解的風險，這是因為行母性遺傳的線粒體DNA并不與物種真實的進化史相吻合或者相匹配[37]。為此，除用線粒體DNA作為進化的分子標記外，研究者還用多個核基因DNA序列分子標記串聯(lián)后構建了棘球絳蟲的分子進化樹[43]。這些核基因DNA分子標記包括elp(Ezrin-radixin-moesin-like protein，埃茲-根蛋白-膜突蛋白樣蛋白)、ef1α(Elongation factor 1 alpha，延伸因子1α)、pepck(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)、polδ(DNA polymerase delta，DNA 聚合酶δ)等[20]。結果表明，核基因DNA分子進化拓撲結構總體上與線粒體基因組序列構建的進化樹的拓撲結構相似，但是核基因DNA分子進化樹的最顯著的特征是少節(jié)棘球絳蟲和伏氏棘球絳蟲不僅位于樹的基部，而且分布于新熱帶的這兩個種之間呈現(xiàn)姊妹關系。這種分子種系發(fā)生分析結果似乎可以得出一可信的假設：幾種貓科動物作為少節(jié)棘球絳蟲的終末宿主，而藪犬(Bush dog，學名Speothosvenaticus)作為伏氏棘球絳蟲的終末宿主，這些食肉動物作為外來“移民”源從北美洲，棘球絳蟲的祖先種顯然是隨著這些貓科動物或者犬科動物宿主侵入南美洲?；涗洷砻?，除了浣熊外再沒有其它有胚盤的食肉動物在南美洲一帶擴張過。北美洲食肉動物大擴散好像發(fā)生在早更新世，它們進化為南美洲本地食肉動物種群。但是，最新的分子進化研究表明，美洲本地新熱帶區(qū)貓科動物的一支——虎貓屬(Leopardus)是更早時候從其它主要貓科譜系衍化來的，這意味著這些小型貓科動物很可能在巴拿馬地峽出現(xiàn)前就侵入了南美洲。只不過，巴拿馬大陸橋的形成可能使得虎貓屬動物物種的進一步分化變得更為便利。正如這一例子所揭示的那樣，食肉動物入侵新熱帶區(qū)的時間節(jié)點以及接下來發(fā)生的動物區(qū)系變化對分析棘球絳蟲種系進化至關重要。假設棘球絳蟲新熱帶區(qū)種的分化和食肉動物的擴張與巴拿馬大陸橋介入動物遷徙相一致，將發(fā)生在約三百萬年前的美洲動物大交換作為棘球絳蟲核基因DNA分子進化的關鍵時間校準點，以新熱帶區(qū)的兩種棘球絳蟲最近的共同祖先存在時間定于三百萬年前構建分子鐘，那么這些推測會表明棘球絳蟲在第三紀中新世結束時(五百八十萬年前)已經開始分化。

棘球屬絳蟲為單系群，在形態(tài)學、發(fā)育和遺傳學組成方面極其相似，關于它的祖先以及帶科絳蟲中棘球屬絳蟲和帶屬(Taenia)中的內鼬帶絳蟲(T.mustela)比較生態(tài)學、生理學和遺傳學關系的科學揭示將對嚴重危害人和動物健康的棘球屬絳蟲的進化史的認識至關重要。

5 小 結

棘球屬絳蟲分子種系發(fā)生、分子分類學和分子進化研究尚處于初始階段，研究方法和手段還不成熟，但是這方面工作的開展無疑會對揭示寄生蟲和宿主相互關系框架的創(chuàng)立起始動和推動作用，對棘球蚴病和其它帶科絳蟲蚴病的防控提供理論指導和奠定基礎。

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