鄧 艷,王珊珊,董 瑩,王 劍

瘧疾為WHO重點關(guān)注的6大熱帶病之一，廣泛分布于北緯60°～南緯30°之間的熱帶、亞熱帶以及部分溫帶地區(qū)。2011年，全球99個國家報告了26萬確認的瘧疾病例，10萬多人死于瘧疾。全球有3.3億人處于感染瘧疾的高風(fēng)險下。云南省瘧疾病例主要集中于保山市和德宏州，以輸入性惡性瘧主，據(jù)統(tǒng)計，2009—2011年惡性瘧病例1 619例，其中318例為來源于緬甸的外籍病例。與中國云南省德宏州盈江縣那邦鎮(zhèn)接壤的緬甸克欽邦第二特區(qū)的一個名為拉咋的小城市，位于北緯24°45′24″，東經(jīng)97°33′47″，海拔263 m，當(dāng)?shù)亟?jīng)濟落后，政局不穩(wěn)，主要經(jīng)濟作物為香蕉，同我國云南尤其德宏州盈江縣邊民往來頻繁，無可避免地影響了我省的瘧疾防控。

經(jīng)檢測顯示中緬、中老邊境地區(qū)惡性瘧原蟲對氯喹普遍具有高度抗性，中部地區(qū)也有約50%的原蟲對該藥產(chǎn)生了抗性[1]。20世紀80年代以來瘧原蟲對青蒿素類藥物敏感性也明顯下降[2]。近年對氯喹抗性產(chǎn)生的分子機制研究發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲氯喹抗性基因pfcrt片段的擴增及點突變與氯喹抗性的產(chǎn)生有關(guān)[3]，即使現(xiàn)場與實驗室研究結(jié)果不完全一致，但相關(guān)研究都肯定該基因與氯喹抗性有關(guān)[4-5]。

Fidock[6]等發(fā)現(xiàn)Pfcrt位于惡性瘧原蟲7號染色體上，有13個外顯子，并與cg2基因緊密連鎖，編碼惡性瘧原蟲氯喹轉(zhuǎn)運蛋白(pfcrt)，該蛋白也是惡性瘧原蟲食物泡膜結(jié)構(gòu)蛋白的組成部分，具有氯喹轉(zhuǎn)運載體功能。Fidock等[6]建立PCR/RFLP方法檢測pfcrt基因76位點突變的方法。研究發(fā)現(xiàn)，全部抗性株的pfcrt都在第76位氨基酸發(fā)生了K-T的突變，即由野生型賴氨酸(Lys)突變?yōu)樘K氨酸(Thr)時，氯喹易化擴散進入瘧原蟲食物泡內(nèi)的效能下降，瘧原蟲可表現(xiàn)為對氯喹有抗性；而敏感株無突變，由此認為惡性瘧原蟲的CQR表型可能有pfcrt基因76號氨基酸編碼突變決定。

鑒于國內(nèi)近年來對惡性瘧原蟲氯喹抗性相關(guān)基因的研究較少，本研究應(yīng)用巢式PCR/RFLP方法對云南省中緬邊境地區(qū)的惡性瘧原蟲相關(guān)抗性基因pfcrt進行了初步的流行病學(xué)研究，以了解該基因目前在中緬邊境惡性瘧中的情況。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 DNA提取試劑盒為QIAamp公司(德國)的DNA Mini Kit(51304)，Taq 酶為天根生化公司的2×PCR Mix試劑盒，上樣緩沖液為TaKaRa 6×Loading Buffer，瓊脂糖為Biowest Regulav AgaroseG-10(lot:11860)。基因擴增儀為杭州博日科技有限公司的TC-96/G/H(b)。電泳儀ELITE300為WEALTEC公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+為BIO RAD公司產(chǎn)品。

1.2血樣采集 惡性瘧原蟲血樣采集地點位于中緬邊境地區(qū)的云南省盈江縣那邦鎮(zhèn)和緬甸拉咱市，對顯微鏡確診的惡性瘧現(xiàn)癥病例采集耳垂血并制作成濾紙血滴，干燥、防蟲保存。

1.3基因組DNA制備 使用QIAamp公司的DNA提取試劑盒DNA Mini Kit，按照操作說明提取基因組DNA，保存于-20℃。

1.4目的基因片段的擴增 根據(jù)文獻[7]合成引物，分別以表1引物及條件進行兩輪PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 pfcrt基因巢式 PCR擴增引物序列及反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系：2×PCR mix混合液25 μL，正向引物(20 μmol/L)0.5 μL，反向引物(20 μmol/L)0.5 μL，第一輪DNA模板3 μL,第二輪以第一輪擴增產(chǎn)物為模板2 μL，去離子水補足體積至總體積為50 μL。

1.5限制性內(nèi)切酶分析和結(jié)果判定 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)總體積為16 μL，其中，含第二輪PCR擴增產(chǎn)物5 μL、Apo I限制性內(nèi)切酶1 μL、10×Apo I Buffer緩沖液1 μL，不足部分用去離子水加至16 μL。50 ℃水浴消化過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、Biao-Rad凝膠成像分析。

經(jīng)RFLP后，若出現(xiàn)149 bp、21 bp(2%瓊脂糖凝膠電泳不可見)條帶組合為Pfcrt基因76位點編碼為突變型，指示惡性瘧原蟲對氯喹有抗性；若出現(xiàn)93 bp、51 bp(2%瓊脂糖凝膠電泳不可見)組合則為Pfcrt基因76位點編碼為野生型，提示惡性瘧原蟲對氯喹無抗性；若同時出現(xiàn)上述多條帶者表明Pfcrt基因76位點編碼突變型和野生型混合存在，仍提示惡性瘧原蟲對氯喹有抗性[4]。

1.6測序及76位點編碼基因型分析 選取Pfcrt基因PCR擴增陽性的樣本進行測序，以內(nèi)側(cè)上、下游引物為測序引物進行雙向測序，測序結(jié)果在NCBI進行BLAST比對，AAA為pfcrt等位基因第76位編碼密碼子野生型，存在1個ApoI酶切位點；ACA為突變型，不存在ApoI酶切位點。

2 結(jié) 果

2.1巢式PCR擴增 對158份惡性瘧現(xiàn)癥病人血樣經(jīng)巢式PCR擴增含有第76位氨基酸的Pfcrt基因片段，其中有117份樣本被擴增出目的基因片段，片段大小為145 bp，如圖1所示，檢出率為74.05%(117/158)。

圖1巢式PCR擴增惡性瘧原蟲pfcrt基因結(jié)果

M ：分子標準， P：陽性對照，1-2：陰性樣本，3-5：陽性樣本

Fig.1ResultsofnestedPCRamplificationofpfcrtgene

M: Marker; P: Positive control; 1-2: Negative sample; 3-5: Positive sample.

2.2RFLP分析 對出現(xiàn)PCR擴增陽性的117份產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶分析，其中112份的酶切產(chǎn)物為150 bp、21 bp片段組合，即112份血樣的Pfcrt基因76位點編碼為突變型，突變率為95.73%(112/117)，見圖2。5份為野生型 。

圖2pfcrt基因擴增和K76T點突變酶切電泳結(jié)果

Fig.2ElectrophoresisresultofpfcrtgeneandK76Tmutationgene

2.3序列測定分析 105份Pfcrt基因PCR擴增產(chǎn)物的雙向測序結(jié)果及AAA、ACA序列位置如圖

3、4所示，突變型和野生型基因的blast比對如圖5所示。野生型pfcrt等位基因第76 位編碼密碼子為AAA，在該段擴增序列中存在一個ApoI酶切位點, 而突變型pfcrt等位基因密碼子為ACA, 在該段序列中就不存在該酶切位點,序列測定結(jié)果與酶切結(jié)果一致。

圖3 野生型pfcrt等位基因序列圖

圖4 突變型pfcrt等位基因序列圖

2.4RFLP與測序結(jié)果的對比分析 102份同時經(jīng)測序和RFLP酶切分析的樣本，除2份測序結(jié)果顯示為野生型，而酶切結(jié)果顯示為突變型外，其余100份樣本序列測定結(jié)果與酶切結(jié)果一致。兩種方法經(jīng)配對X2檢驗，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 野生型和突變型pfcrt等位基因blast比對結(jié)果

Tab.2Comparativeanalysisonthemutationatcodon76ofpfcrtgene

RFLPSequencingAAAACATotal150/2311293/51298100Total399102

3 討 論

Pfcrt位于惡性瘧原蟲7號染色體上，36 kb大小，含有13個外顯子，編碼氯喹抗性轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白位于消化泡膜上，pfcrt發(fā)生的點突變可能影響氯喹在食物泡中的富集，或可影響膜兩側(cè)的離子交換從而影響氯喹富集所需的PH值而產(chǎn)生對氯喹的抗性。研究發(fā)現(xiàn)Pfcrt存在8個密碼子變異，它們分別位于72、74、75、97、220、271、326、356和371位點，但K76T是與氯喹抗性關(guān)系最為密切的。

本文以董瑩[7]等的方法合成引物對惡性瘧原蟲病人的血樣進行pfcrt基因76位點進行PCR擴增，擴增成功率為74.05%(117/158)，低于董瑩[7]、王安平[8]、官亞宜[9]、楊亞明[10]等的研究結(jié)果，影響檢出率的最大因素可能與樣本采集時血量不夠及采樣時間和檢測時間間隔過長有關(guān)。

同時用RFLP和序列測定兩種方法研究pfcrt基因76位點的突變。結(jié)果顯示，RFLP檢測中緬邊境地區(qū)pfcrt基因76位點的突變率為95.37%(112/117)，這一結(jié)果與董瑩[7]和楊亞明[1]等對云南省惡性瘧pfcrt基因K76TD的研究結(jié)果基本一致(K76TD的突變率分別為94.12%和85%)，抗氯喹惡性瘧的檢出率也與楊恒林[2]等采用體外微量法的檢出結(jié)果符合，但95.37%的pfcrt基因76位點突變率高于王安平[8]和官亞宜[9]對海南省惡性瘧原蟲的45.16%和64.3%突變率。測序方法分析pfcrt基因76位點的基因型顯示，突變率為97.06%(99、102)，略高于RELP分析結(jié)果，兩者結(jié)果的不一致，可能由于測序過程中的堿基錯配形成，但兩者無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，因此即使兩者結(jié)果不一致，仍然不影響最終結(jié)果的判定。

本文結(jié)果提示Pfcrt可以作為云南省監(jiān)測惡性瘧對氯喹抗性的分子標志之一。還提示從1994年以來，云南省中緬邊境的氯喹抗性在pfcrt基因水平無改變，只是檢測的實驗不多。而國內(nèi)外資料表明：即使存在K76T突變的惡性瘧原蟲株仍有可能對氯喹敏感[11]，因此尚不能輕易作出云南省中緬邊境氯喹抗藥性仍普遍存在的結(jié)論。今后應(yīng)作更多的檢測。

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