劉 蕓，孫婷婷，張 潔，王子江，姚文清，趙 卓

2010年5月，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心在湖北、河南兩省的部分地區(qū)啟動(dòng)了發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例的監(jiān)測(cè)工作，發(fā)現(xiàn)了一種屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新型病毒。目前，該病毒被命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)簡(jiǎn)稱新布尼亞病毒，該病毒是引起發(fā)熱伴血小板減少病例的致病因子[1-2]。

遼寧省自2009年從VERO-E6細(xì)胞中分離出陽(yáng)性病毒株[3]，經(jīng)過(guò)國(guó)家疾控中心確定為SFTSV后，經(jīng)過(guò)5年的努力，實(shí)驗(yàn)室對(duì)該新發(fā)傳染病的病原微生物的檢測(cè)方法日臻成熟，已建立了完整的檢測(cè)手段。下面就將2013.1-2013.12收集到的180份疑似發(fā)熱伴血小板減少病例樣本采用實(shí)時(shí)熒光PCR(Real time-PCR)法、酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法及VERO-E6細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒的方法進(jìn)行檢測(cè)比較。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來(lái)源 樣本來(lái)自2013年遼寧省發(fā)熱伴血小板減少綜合征專項(xiàng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)收集的符合病例要求的180份病例。每個(gè)樣本均有臨床診治結(jié)果和流行病學(xué)調(diào)查資料，同時(shí)采集患者急性期血液3 mL×3管。一管分離血清，-20 ℃保存留作抗體檢測(cè)使用；余下兩管均-70 ℃保存其中一管留作核酸檢測(cè)及細(xì)胞分離病毒使用，另一管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試驗(yàn)試劑與儀器 RNA提取試劑盒 EZ1 virus Mini Kit v2.0 購(gòu)置德國(guó)QIAGEN公司，Cat.No.955134。新布尼亞病毒RNA檢測(cè)試劑盒來(lái)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，Cat.#DN-BN196。ELISA抗體檢測(cè)試劑盒來(lái)自萬(wàn)泰生物藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)為：20120601-1。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑均由GIBCO公司提供，VERO-E6第25代細(xì)胞由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。熒光定量PCR儀(MJ)由美國(guó)生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，型號(hào)SUNRISE由澳大利亞生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例的檢測(cè)[4-5]取SFTSV感染的患者急性期血液200 μL，用RNA提取試劑盒參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA。將提取的RNA取5 μL作為模板，用新布尼亞病毒RNA檢測(cè)試劑盒采用FAM通道，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min;95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，35個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)果：Ct值≤35.00為陽(yáng)性；無(wú)Ct值為陰性，Ct值在35～40之間為可疑陽(yáng)性:需要從新檢測(cè)或增加另外兩種方法協(xié)助檢測(cè)。

1.2.2采用ELISA法對(duì)SFTSV感染者的血清進(jìn)行抗體檢測(cè)[6]取待檢血清10 μL按操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照。臨界值(CUTOFF)計(jì)算：臨界值=0.10 +陰性對(duì)照孔A均值。當(dāng)陰性對(duì)照孔低于0.02時(shí)按0.02計(jì)算。樣品A值≥臨界值者為新布尼亞病毒抗體(IgM或IgG)陽(yáng)性，<臨界值者為陰性。

1.2. 采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法將180例疑似SFTSV感染者的血液提取RNA做核酸檢測(cè)，篩選Ct值≤35.00的樣本77例全部感染VERO-E6細(xì)胞，盲傳3代。SFTSV可致VERO-E6細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)時(shí)間為9～12 d[7]。將CPE陽(yáng)性的培養(yǎng)液取出200 μL做SFTSV核酸檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.13種方法檢測(cè)結(jié)果比較 180例樣本采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)，陽(yáng)性77例，陽(yáng)性率42.78%(77/180)；將77例感染SFTSV的樣本應(yīng)用ELISA法檢測(cè)，能產(chǎn)生抗體陽(yáng)性的占34例，陽(yáng)性率44.16%(34/77)；77例核酸陽(yáng)性的樣本經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后獲得CPE陽(yáng)性分離株32株，陽(yáng)性率41.56%(32/77)。

2.2不同方法檢出率同發(fā)病時(shí)間、取樣時(shí)間的關(guān)系 3種方法檢測(cè)77例新布尼亞病毒感染者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性檢出率與發(fā)病時(shí)間及采血時(shí)間有密切的聯(lián)系，見(jiàn)表1。

因樣本例數(shù)少，只能采用Fisher確切概率法對(duì)男、女感染SFTSV的幾率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如下：雙側(cè)P值是1.000，單側(cè)P值是0.667，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)是一種新發(fā)傳染病[8-9]，檢測(cè)方法很多，但我們省級(jí)實(shí)驗(yàn)室最常使用的檢測(cè)方法有3種，即實(shí)時(shí)熒光PCR法、ELISA法及細(xì)胞培養(yǎng)的方法。通過(guò)對(duì)我省2013年1-12月收集的180例臨床疑似發(fā)熱伴出血、伴血小板減少的病例樣本檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)方面的問(wèn)題現(xiàn)闡述如下：

表1 3種方法檢測(cè)不同月份感染病例陽(yáng)性結(jié)果比對(duì)

表2 不同的采血時(shí)間對(duì)檢測(cè)方法的影響

表3 77份SFTSV陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的人群分布

我省SFTSV流行特點(diǎn)：年齡為40～60歲青壯年為主，男女不限。從首發(fā)病例2013年5月17日起至最后一例為10月24日可見(jiàn)，春、冬兩季無(wú)病例，夏、秋季節(jié)為流行高峰。該季節(jié)空氣濕潤(rùn)草木茂盛，節(jié)肢動(dòng)物(如：蜱)[10]繁殖密度大，人和動(dòng)物被感染的幾率較高。寒冷季節(jié)蜱蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物處于冬眠狀態(tài)或隨宿主轉(zhuǎn)入洞穴生存，對(duì)人和家畜感染的機(jī)會(huì)小。其二，9-10月份樣本SFTSV核酸檢測(cè)陽(yáng)性32例，感染細(xì)胞后陽(yáng)性分離率為15.63%(5/32)較7-8月份核酸檢測(cè)陽(yáng)性36例，感染細(xì)胞后陽(yáng)性分離率為55.56%(20/36)降低了許多，樣本保存不當(dāng)或試驗(yàn)操作誤差等因素除外，自2010起至2013年止對(duì)此現(xiàn)象我們一直在觀注。分析原因可能是伴隨SFTSV感染的同時(shí)，還有一種致病因子協(xié)同存在，基因型與之相似或者還有一種新的SFTSV血清型存在，該病原微生物可能存在于我們已經(jīng)了解的蜱蟲(chóng)之外的其它節(jié)肢動(dòng)物，同時(shí)對(duì)VERO-E6細(xì)胞不敏感；或者SFTSV對(duì)感染VERO-E6細(xì)胞而言有兩種情況，一種是嗜VERO-E6細(xì)胞型，令一種是對(duì)VERO-E6細(xì)胞不敏感型這一結(jié)果有待于我們今后工作中進(jìn)一步證實(shí)。

3種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)的方法雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力適用于科研及疫苗研制，不適用于臨床診斷。ELISA試驗(yàn)是檢測(cè)患者被SFTSV感染后機(jī)體產(chǎn)生抗體水平的。從我們檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，IgM抗體最早產(chǎn)生的時(shí)間是病后1 d；最晚1例是病后第28 d采血時(shí)，IgM仍陰性，核酸檢測(cè)陽(yáng)性(Ct=30.10)，細(xì)胞培養(yǎng)陰性。在發(fā)病第15天時(shí)采血還能分離出病毒者僅1例。3種方法同時(shí)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)的最佳采血時(shí)間是病后4～7 d。根據(jù)這一結(jié)果推斷SFTSV感染機(jī)體后，病毒血癥期維持時(shí)間較長(zhǎng)可能與個(gè)體免疫水平有關(guān)。采用ELISA方法作為該病毒早期感染的確證試驗(yàn)不合適，容易造成假陰性；而實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單快速，結(jié)果觀察直觀應(yīng)該成為臨床診斷和病毒株分離前篩選樣本的首選方法。病毒株的陽(yáng)性分離率與樣本的采集時(shí)間、保存狀態(tài)、敏感細(xì)胞的選擇等因素有關(guān)，與感染者的年齡、性別因素?zé)o關(guān)。

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