陳彩珍，盧 健

(1.青少年健康評價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華東師范大學(xué)，上海 200241;2.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海 200241)

衰老過程中肌質(zhì)量和力量的漸進(jìn)性下降(即sarcopenia，骨骼肌衰減征)嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，致病率和致死率增加。研究發(fā)現(xiàn)，Sarcopenia的發(fā)生與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量減少或激活能力降低密切相關(guān)［1-4］。而胰島素樣生長因子(IGF-I)是刺激衛(wèi)星細(xì)胞活性和增殖、激發(fā)肌肉再塑的一個(gè)重要細(xì)胞因子，參與促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育、組織修復(fù)、營養(yǎng)代謝及細(xì)胞分化等，尤其對促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，減少脂肪，改善體質(zhì)成分有顯著的作用;生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)是調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生成最重要、最關(guān)鍵的調(diào)控因子，它包括MyoD(肌分化因子，Myogenic Determination)，Myf5(肌生成素5)，myogenin(肌細(xì)胞生成素)和MRF4(肌肉調(diào)節(jié)因子4)。MyoD可誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化成成肌細(xì)胞，myogenin則發(fā)揮著調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞終末分化融合為肌管肌纖維的功能。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能通過激活衛(wèi)星細(xì)胞并維持其增殖分化進(jìn)而增加骨骼肌質(zhì)量和力量，這一過程伴隨著復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，可能與骨骼肌自身分泌的多種細(xì)胞因子有關(guān)，其中IGF-1和MRFs的合成、分泌、調(diào)節(jié)對衛(wèi)星細(xì)胞的激活有重要的影響。研究IGF-1和MRFs在不同運(yùn)動(dòng)方式中肌細(xì)胞分化和發(fā)育調(diào)控的分子生物學(xué)機(jī)制，對闡明肌肉損傷、骨骼肌萎縮或肥大的機(jī)理具有重要作用。探尋何種類型的肌肉負(fù)荷有助于肌質(zhì)量的維持進(jìn)而改善肌肉功能，這對延緩sarcopenia的發(fā)生發(fā)展、改善老年機(jī)體的機(jī)能亦有實(shí)質(zhì)性的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡SAMP8(senescence accelerated mouse/prone，快速老化小鼠)21只，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證編號(hào):W-J津?qū)崉?dòng)質(zhì)M準(zhǔn)字第006號(hào))。隨機(jī)分為3組，分別為對照組(C)、耐力訓(xùn)練組(E)、抗阻訓(xùn)練組(R)、每組7只。在IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)中分籠飼養(yǎng)，每日自由飲水，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，12小時(shí)光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22±2℃，濕度40-60%。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

耐力運(yùn)動(dòng):8w跑臺(tái)訓(xùn)練，參照 Siu PM訓(xùn)練方案［5］?？棺柽\(yùn)動(dòng):尾部負(fù)重爬梯訓(xùn)練(爬梯由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)自制，高1m，每級梯階間隔1.5cm，傾斜85°)。訓(xùn)練方案參照文獻(xiàn)［6］摸索適宜的負(fù)重重量(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度)，爬梯的重復(fù)次數(shù)(運(yùn)動(dòng)量)及每組訓(xùn)練的時(shí)間間隔，分別為 3Sets/day，3-4Reps/Set，間隔 20s/Rep，2min/Set。具體訓(xùn)練方案見表1。

表1 8周漸增強(qiáng)度耐力、抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

1.3 主要試劑和儀器

試劑:TRIzol Reagent，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen 公司)，Goldview(上海賽百盛)，Loading bueffer(天根生化科技有限公司)，RNA酶抑制劑，Oligo dT15 primer，dNTP Mix(TaKaRa)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)。

儀器:IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)(杭州紹豐公司)，立式高速冷凍離心機(jī)(Beckman)，Step One Real-time PCR儀(ABI)，水平/垂直電泳槽，穩(wěn)壓電泳儀，PCR儀(Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)，石蠟包埋機(jī)、冰凍切片機(jī)、石蠟烤片機(jī)(LEICA)。

1.4 樣本的采集

末次運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)，將實(shí)驗(yàn)鼠稱重，斷頭處死。迅速取小鼠右側(cè)腓腸肌，經(jīng)預(yù)冷PBS緩沖液沖洗干凈，稱重，分為3部分(錫紙包裹)，腓腸肌中部置入新鮮配置的10%甲醛中固定備石蠟切片，剩余部分暫置液氮保存后放置-80℃超低溫冰箱中待RT-PCR檢測。

1.5 骨骼肌纖維橫截面積的測量

腓腸肌固定后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后常規(guī)制作厚6μm的石蠟切片，采用蘇木精伊紅法進(jìn)行染色并拍照，Leica Qwin軟件統(tǒng)計(jì)肌纖維橫截面積、直徑。

1.6 樣品RNA的抽提及總RNA的質(zhì)量和純度檢測

Trizol法提取樣本總RNA，經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，顯示清晰的28S、18S、5S條帶，核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA A260/A280＞1.8，提示總RNA完整性和質(zhì)量較好。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄

反應(yīng)體系的總體積為 20μl，DEPC 水8μl，RNA 酶抑制劑(50U/μl)0.5μl，隨機(jī)引物(50pM/ul)2μl，RNA 2μg，65℃水浴處理 5min，室溫放置 10min，高速(高于5 000g)離心5s。繼續(xù)加入反應(yīng)物:RNA酶抑制劑(50U/μl)0.5μl，5xbuffer 4μl，dNTP MIX(1omM/each)2μl，DTT 2μl，M-MLV(200Uu/l)1μl。37℃水浴1h，90℃處理 5-10min，冰浴 5min，高速(高于 5 000g)離心 5s。

1.8 引物設(shè)計(jì)、合成及RT-PCR反應(yīng)條件

通過genebank查到大鼠 IGF-1Ea、MGF、mygenin和myodmRNA序列，用Primer5.0自行設(shè)計(jì)引物序列，由上海英駿生物科技公司合成(見表2)。用β-actin作為“管家基因”(house keeping gene)，用以監(jiān)控總RNA使用量，以消除不同樣本間加樣誤差。

1.9 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15μl，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，goldenview染色，100伏電泳30分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，應(yīng)用ImgaerTM2200分析軟件進(jìn)行各個(gè)樣本的不同基因表達(dá)量檢測。將檢測基因的檢測值除以GAPDH的檢測值，即為該標(biāo)本基因的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5處理，單因素方差分析。以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01為差異極顯著。

表2 檢測基因的引物序列及RT-PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果

2.1 小鼠腓腸肌濕重體重比及肌纖維橫截面積檢測

由表3、圖1可見，抗阻訓(xùn)練組腓腸肌濕重/體重比值(RM)極顯著高于對照組和耐力訓(xùn)練組(P＜0.01)。與對照組比較，抗阻訓(xùn)練組小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積有顯著增大(P＜0.05)，而耐力訓(xùn)練組與對照組比較無顯著性差異;抗阻訓(xùn)練組腓腸肌肌纖維橫截面積亦顯著高于耐力訓(xùn)練組(P＜0.05)。

表3 小鼠腓腸肌肌濕重體重比(RM)及肌纖維橫截面積(CSA)

圖1 各組小鼠腓腸肌纖維橫截面積照片(×40)

2.2 運(yùn)動(dòng)對小鼠腓腸肌IGF-I、MGF和成肌調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)的影響

耐力訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練后，小鼠腓腸肌IGF-ImRNA表達(dá)均升高，與對照組相比有顯著性差異(分別P＜0.05，P＜0.01)，兩運(yùn)動(dòng)組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P=0.086)，但抗阻訓(xùn)練組IGF-ImRNA表達(dá)有增加的趨勢。

耐力訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練后，小鼠腓腸肌MGFmRNA表達(dá)均顯著升高，與對照組相比有顯著性差異(分別P＜0.05，P＜0.01)。兩訓(xùn)練組之間比較，抗阻訓(xùn)練組腓腸肌MGFmRNA表達(dá)極顯著耐力訓(xùn)練組(P＜0.01)。

表4 小鼠腓腸肌IGF-I、MGF mRNA的表達(dá)

小鼠腓腸肌MyoDmRNA及myogenin mRNA表達(dá)趨勢相似，即與對照組相比，耐力訓(xùn)練組和抗阻訓(xùn)練組均顯著性升高(分別P＜0.05，P＜0.01);兩運(yùn)動(dòng)組之間比較卻未發(fā)現(xiàn)顯著性升高，但抗阻運(yùn)動(dòng)組有增加的趨勢(見表5)。

表5 小鼠腓腸肌MyoD、myogenin mRNA的表達(dá)

3 討論

sarcopenia是衰老過程中出現(xiàn)的肌肉質(zhì)量和力量下降的退行性變化，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，也是一些慢性疾病的誘發(fā)原因。但改善肌肉質(zhì)量一直得不到重視。大量的研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)仍然是保持肌肉整體機(jī)能最有效的方法［6］。運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌肥大的機(jī)制已有近百年的研究歷史，并且一直是備受運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)課題。

骨骼肌纖維是一種終末分化的細(xì)胞類型，主要由成肌細(xì)胞分化而來。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞存在于肌膜和基膜之間。正常情況下，衛(wèi)星細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，當(dāng)肌肉受到損傷刺激時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞被激活、增殖、變成紡錘形的成肌細(xì)胞，繼而融合成肌管，形成新的肌纖維［7］。在骨骼肌生長發(fā)育過程中，肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖與分化等復(fù)雜的生理過程受多種激素和生長因子的調(diào)控。如IGF-I、MRFs等。骨骼肌IGF-I有3種亞型:IGF-IEa、IGF-IEb、IGF-IEc。IGF-IEc 也稱機(jī)械生長因子(mechano growth factor，MGF)，它具啟動(dòng)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、抑制分化、促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)等功能，作用于骨骼肌肥大的初始階段［8］。IGF-IEa主要表現(xiàn)為刺激成肌細(xì)胞的融合和肌纖維的增大，即作用于骨骼肌肥大的后程階段［9］。

MRFs也稱為MyoD家族，是在骨骼肌胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的一組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。研究顯示，MyoD家族成員都參與成肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的分化過程，對于維持體內(nèi)肌肉的生成起關(guān)鍵作用。其中，MyoD對肌細(xì)胞分化的啟動(dòng)、多種細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［10］。myogenin是肌細(xì)胞終末分化的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞終末分化融合為肌管肌纖維。

年齡相關(guān)的Sarcopenia以I、II型肌纖維丟失，尤以II型肌纖維橫截面積下降為主，該現(xiàn)象能被機(jī)械負(fù)荷所阻斷，機(jī)械負(fù)荷能增大肌纖維橫截面積，但不能恢復(fù)肌纖維數(shù)量至年輕時(shí)的水平［11］。目前關(guān)鍵要考慮哪種形式的肌肉負(fù)荷對老年個(gè)體保存肌肉質(zhì)量、延緩Sarcopenia的進(jìn)程最有效?？棺栌?xùn)練是完全依靠自身力量克服一定外界阻力的運(yùn)動(dòng)，是唯一能顯著提高肌肉質(zhì)量的運(yùn)動(dòng)方式。有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能增強(qiáng)肌肉耐力水平，明顯有利于心血管健康，但它并不能有效增加肌質(zhì)量和力量［12-13］。不同運(yùn)動(dòng)方式可能對衛(wèi)星細(xì)胞的激活、骨骼肌肥大產(chǎn)生不同程度的影響［14-17］。

本研究中主要通過檢測衛(wèi)星細(xì)胞激活、骨骼肌肥大過程中的幾個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子的基因表達(dá)，比較耐力訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化能力的作用及可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是耐力訓(xùn)練還是抗阻訓(xùn)練均能顯著上調(diào)腓腸肌IGF-1、MGF、MyoD及 myogenin等mRNA的表達(dá)，尤其是抗阻訓(xùn)練組變化幅度更大，升高更顯著。但是在觀察腓腸肌橫截面積時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)8周的耐力訓(xùn)練并不能有效增大腓腸肌橫截面積，而抗阻訓(xùn)練這一指標(biāo)得到顯著提高，提示這兩種形式的運(yùn)動(dòng)均能在基因轉(zhuǎn)錄水平影響IGF-1兩個(gè)亞型及MyoD家族兩個(gè)成員的表達(dá)。但由于抗阻運(yùn)動(dòng)是肌肉克服施加其上的阻力產(chǎn)生收縮的運(yùn)動(dòng)方式，其對肌肉本身的影響更直接，更有助于刺激肌肉肥大，提高肌肉力量;而耐力訓(xùn)練對骨骼肌的刺激相對溫和些，對肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響程度也相對弱些，最終表現(xiàn)為肌質(zhì)量的有限改善。根據(jù)MGFmRNA在兩種不同訓(xùn)練方式中的表達(dá)差異可清楚看到，本研究采取的負(fù)重爬梯抗阻訓(xùn)練可顯著上調(diào)MGFmRNA的表達(dá)，與耐力訓(xùn)練組比較有顯著差異。MGF，也稱為力生長因子或機(jī)械生長因子，它對力刺激特別敏感。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，理論上大鼠可以負(fù)重350%-400%自身體重;如負(fù)荷低于200%，不足以有效誘發(fā)骨骼肌肥大［18-19］。而本實(shí)驗(yàn)所用小鼠為6月齡SAMP8快速老化鼠，處于中老年階段，根據(jù)這些小鼠的具體情況，實(shí)驗(yàn)中對其負(fù)荷量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，即在8周訓(xùn)練中負(fù)荷逐漸加大，直至100%體重。運(yùn)動(dòng)中，肌肉組織應(yīng)答過載的機(jī)械壓力時(shí)MGF基因表達(dá)特別敏感，而且先于IGF-I和IGFIEa的表達(dá)［20］。在負(fù)重爬梯訓(xùn)練時(shí)不僅具有過載的負(fù)荷，還可產(chǎn)生機(jī)械性應(yīng)答刺激促進(jìn)MGFmRNA的表達(dá)，而耐力訓(xùn)練在這兩方面的作用效果并不明顯［21］。本研究結(jié)果同時(shí)也提示耐力訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練在激活肌衛(wèi)星細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制上的區(qū)別，可能涉及不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的不同水平。由于本研究僅針對肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了觀察，故尚不能明晰耐力訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練在影響肌質(zhì)量方面差異的真正原因。

綜上分析，在骨骼肌對運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)過程中牽涉到眾多物質(zhì)的量或活性的相應(yīng)變化，雖然IGF-1或MRFs在骨骼肌對運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練尤其是抗阻訓(xùn)練的肥大適應(yīng)中均發(fā)揮了重要作用，但它們對機(jī)械負(fù)荷的應(yīng)答方式不盡相同，它們的時(shí)空表達(dá)具有特異性，彼此之間有較大差異，故還需要從多角度、多層次、多手段深入研究。

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