裴陽(yáng)晴，劉素娜，暴 磊，張紅義，侯建永，郝長(zhǎng)付，姚 武

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 河南 鄭州450001)

目前世界各國(guó)對(duì)塵肺病進(jìn)行了大量的研究，但塵肺病的發(fā)病機(jī)制仍然不十分明確［1-2］。近年來(lái)的研究表明，塵肺病肺纖維化發(fā)生發(fā)展的過(guò)程與機(jī)體免疫功能變化密切相關(guān)。塵肺患者的免疫系統(tǒng)能夠感知自身細(xì)胞蛋白或多肽的異常表達(dá)，并使機(jī)體形成相應(yīng)的自身抗體，這些自身抗體是與塵肺病發(fā)生相關(guān)的分子事件的感知者和應(yīng)答者，是一種潛在的診斷塵肺病的生物標(biāo)記物。課題組的前期研究應(yīng)用抗體庫(kù)技術(shù)成功篩選出人源塵肺病的6 種強(qiáng)陽(yáng)性克隆抗體［3-4］，其中發(fā)現(xiàn)顆粒酶B(Granzyme B，GzmB)抗體在塵肺病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有一定作用。

此次研究采用人群流行病學(xué)調(diào)查研究，對(duì)煤工塵肺患者及接塵工人血清中GzmB 抗體的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其與塵肺病的關(guān)系。

1 調(diào)查對(duì)象和方法

1.1 調(diào)查對(duì)象 選擇調(diào)查對(duì)象1 260例，分為4 組，其中:觀察對(duì)象組230例，為河南省診斷X 射線胸片已出現(xiàn)塵肺病變但尚未達(dá)到壹期塵肺的男性煤礦工人;接塵組309例，為同地區(qū)相同工作環(huán)境中正在接塵但X 射線胸片尚未出現(xiàn)塵肺病變表現(xiàn)的男性煤礦工人;病例組328例，為根據(jù)現(xiàn)行塵肺病X 線診斷標(biāo)準(zhǔn)(GBZ70-2009)確診為煤工塵肺患者的同地區(qū)男性煤礦工人;健康對(duì)照組393例，為河南省某醫(yī)院的男性健康體檢者。所有研究對(duì)象均接受問(wèn)卷調(diào)查，且均排除自身免疫病及其他肺部疾病。

1.2 研究方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent serologic assay，ELISA)法檢測(cè)所有調(diào)查對(duì)象血清中GzmB 抗體的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用Excel 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以(±s)表示，采用方差分析或t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查對(duì)象基本情況 調(diào)查對(duì)象共1 260例，其中觀察對(duì)象組、煤工塵肺患組、接塵組和健康對(duì)照組分別有230例、328例、309例和393例)。調(diào)查對(duì)象的工齡、吸煙及飲酒史差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 調(diào)查對(duì)象的基本情況

2.2 調(diào)查對(duì)象血清中GzmB 抗體的水平比較 由表2可見(jiàn)，煤工塵肺患者血清中GzmB 抗體表達(dá)水平高于接塵組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);煤工塵肺組血清中GzmB 抗體表達(dá)水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 煤工塵肺組內(nèi)不同期別人群血清中GzmB 抗體表達(dá)水平的比較 3 組人員血清中GzmB 的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 調(diào)查對(duì)象血清中GzmB 抗體表達(dá)水平的比較(±s)

表2 調(diào)查對(duì)象血清中GzmB 抗體表達(dá)水平的比較(±s)

注:與煤工塵肺比較* P ＜0.05。

分期 n OD值230 1.416±0.450煤工塵肺組 328 1.478±0.450接塵組 309 1.325±0.463*對(duì)照組 393 1.377±0.430*F 6.661 P觀察對(duì)象組＜0.001

2.4 工齡對(duì)觀察對(duì)象、煤工塵肺組不同期別GzmB抗體表達(dá)的影響 由于叁期塵肺病例數(shù)太少，故將貳期塵肺與叁期塵肺合并成為一組。將工種分為3 組，工齡按照中位數(shù)25年分為兩組。對(duì)不同工齡的塵肺患者比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，壹期塵肺組中，＜25年血清中GzmB抗體的表達(dá)低于≥25年組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。在工齡≥25年組中，觀察對(duì)象組血清中GzmB抗體的表達(dá)低于壹期塵肺組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表4。

表3 煤工塵肺組中不同期別人群血清GzmB 抗體表達(dá)水平(±s)

表3 煤工塵肺組中不同期別人群血清GzmB 抗體表達(dá)水平(±s)

分期 n OD值259 1.488± 0.451貳期塵肺 60 1.459± 0.446叁期塵肺 9 1.311± 0.423 F 0.739 P壹期塵肺0.478

表4 不同工齡血清GzmB 抗體表達(dá)水平的比較(±s)

表4 不同工齡血清GzmB 抗體表達(dá)水平的比較(±s)

注:與觀察對(duì)象組中工齡＞25年組比較* P ＜0.05，與壹期塵肺組中工齡＜25年組比較P ＜0.05。

工齡觀察對(duì)象組n OD 值壹期塵肺組n OD 值貳期和叁期塵肺組n OD 值F P 42 0.072 0.930≥25年 92 1.380±0.432 157 1.534±0.443* 36 1.458±0.449 3.589 0.029 t 0.993－2.026 0.357 P＜25年 138 1.440±0.461 102 1.418±0.457 33 1.420±0.4 0.322 0.044 0.722

3 討論

GzmB 是自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞所分泌的，進(jìn)入靶細(xì)胞后引起caspases 的鏈鎖反應(yīng)［5］，致使靶細(xì)胞DNA 的降解，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，GzmB 可通過(guò)3 種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且是其中重要的效應(yīng)分子［6］。在肺纖維化發(fā)生時(shí)，成纖維細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白含量的增加，提示成纖維細(xì)胞正在向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是纖維化發(fā)生的標(biāo)志之一［7-8］。有研究［9］通過(guò)建立GzmB 抗體抑制大鼠矽肺模型，發(fā)現(xiàn)抑制組α-SMA、ColⅠ和ColⅢmRNA 和蛋白的表達(dá)水平顯著高于空白組和二氧化硅處理組，提示抑制大鼠肺成纖維細(xì)胞GzmB 抗體，對(duì)二氧化硅致成纖維細(xì)胞激活具有抑制作用。

該研究通過(guò)ELISA 技術(shù)檢測(cè)觀察對(duì)象、煤工塵肺患者、接塵工人以及健康人群血清中GzmB 抗體的表達(dá)。結(jié)果顯示，對(duì)照組人群與接塵工人血清中GzmB抗體的表達(dá)水平均低于煤工塵肺患者，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且對(duì)照組、觀察對(duì)象組和煤工塵肺組人群血清GzmB 抗體的表達(dá)逐漸增加。分析原因可能是由于在煤工塵肺的發(fā)生過(guò)程中，CTL 通過(guò)穿孔素/顆粒酶途徑作用于吞噬粉塵顆粒或者被粉塵顆粒破壞的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞，并引起這些細(xì)胞DNA 降解，同時(shí)釋放Fas 配體和炎癥細(xì)胞因子，這些可溶性效應(yīng)分子的釋放能夠激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化增殖，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，但也會(huì)破壞正常的肺巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞并引起非特異性的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肺組織。這些非特異的炎癥細(xì)胞能加重CTL誘導(dǎo)的組織損傷并最終并加重纖維化反應(yīng)。有研究通過(guò)建立穿孔素基因敲除小鼠肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)穿孔素基因敲除小鼠肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯少于野生型小鼠，說(shuō)明穿孔素和GzmB 介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)與肺纖維化有一定聯(lián)系［10］。此外張彬等［11］檢測(cè)IL-2、IL-12 對(duì)NK-92 細(xì)胞系表達(dá)顆粒酶基因的影響發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-12等Th1 型細(xì)胞因子可以上調(diào)NK-92 細(xì)胞中GzmB 基因轉(zhuǎn)錄水平，而在煤工塵肺病早期，矽塵進(jìn)入肺內(nèi)損傷和激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，分泌大量的Th1型細(xì)胞因子，這都與研究發(fā)現(xiàn)相一致。

在對(duì)不同期別煤工塵肺患者血清中GzmB 抗體的表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然不同期別之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但患者血清中GzmB 抗體的表達(dá)隨塵肺分期的增高有降低的趨勢(shì)，推測(cè)可能與肺組織纖維化的嚴(yán)重程度有關(guān)。隨著煤工塵肺的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)Th1 型細(xì)胞因子占劣勢(shì)，Th2 型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)時(shí)，由于Th1 型細(xì)胞因子減少降低了顆粒酶B 的基因轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)由于肺組織纖維化的加重，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞作用于肺正常細(xì)胞導(dǎo)致組織損傷的機(jī)制被抑制，因此患者血清中GzmB 抗體的表達(dá)逐漸減少。

在對(duì)工齡研究時(shí)發(fā)現(xiàn)粉塵接觸史長(zhǎng)的患者血清中GzmB 抗體的表達(dá)水平高于接觸史較短的患者，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在煤工塵肺中，隨著接塵時(shí)間的增加，GzmB 大量釋放，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等效用細(xì)胞凋亡，加重肺纖維化，因此產(chǎn)生大量GzmB 抗體以抑制肺纖維化。

綜上所述，煤工塵肺患者血清中GzmB 抗體表達(dá)水平增高且與接塵工齡正相關(guān)，提示GzmB 抗體可能通過(guò)參與了煤工塵肺的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，具體機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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