康輝+羅麗娟+蔡素芬+鄒崢

[摘要] 目的 探討Th17細胞在兒童丙種球蛋白耐藥性川崎病發(fā)病機制中的作用。 方法 選擇2013年5月～2014年5月本院診斷為川崎病的患兒100例作為研究對象，根據(jù)是否存在耐藥性分為丙種球蛋白耐藥組和非丙種球蛋白耐藥組，選擇30例正常兒童作為健康對照組，收集研究對象外周血4～5 ml，提取外周血單個核細胞，采用流式細胞術(shù)檢測Th17細胞，采用熒光定量PCR檢測IL-23P19與RORrt基因mRNA表達量。 結(jié)果 丙種球蛋白耐藥組外周血PBMC中Th17細胞占CD4+細胞百分率明顯高于非丙種球蛋白耐藥組、健康對照組，且非丙種球蛋白耐藥組高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；丙種球蛋白耐藥組及非丙種球蛋白耐藥組RORrt基因表達量高于健康對照組（P<0.05）；非丙種球蛋白耐藥組IL-23P19基因mRNA表達量與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 Th17細胞表達與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病具有相關(guān)性，這為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供新的研究途徑，有利于減少川崎病患兒心血管損傷的后遺癥，保護兒童身心健康，具有較大的社會效益和經(jīng)濟效益。

[關(guān)鍵詞] 輔助性T淋巴細胞17；丙種球蛋白耐藥型川崎病；發(fā)病機制

[中圖分類號] R54 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）10（a）-0024-03

川崎病是一種病因不明的以全身中、小血管炎為主要病變的兒童急性發(fā)熱出疹性疾病，可導(dǎo)致冠狀動脈損害[1]。大劑量丙種球蛋白聯(lián)合阿司匹林是公認的有效方法，但仍有10%～20%患兒對丙種球蛋白耐藥，其冠狀動脈損害發(fā)生率達48.6%[2]。治療前就可前瞻性地判斷丙種球蛋白的有效性，在緩解患者病情、減少各種并發(fā)癥方面具有重大意義。目前，在國內(nèi)外報道Th17細胞表達川崎病發(fā)病機制中作用研究方面基本很少，而Th17細胞表達在丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病機制中的作用方面的報道更是少數(shù)。本研究通過流式細胞術(shù)及熒光定量PCR對丙種球蛋白耐藥型川崎病患者的Th17細胞進行檢測，從細胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17細胞表達與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的治療及預(yù)后提供新的研究途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年5月～2014年5月在本院診斷為川崎病的患兒100例作為研究對象，根據(jù)是否存在耐藥性分為丙種球蛋白耐藥組和非丙種球蛋白耐藥組，另選擇30例正常兒童作為健康對照組。非丙種球蛋白耐藥組共80例，年齡5個月～6歲，男性56例，女性24例；丙種球蛋白耐藥組20例，年齡6個月～6歲，男性14例，女性6例；健康對照組30例，年齡7個月～6.4歲，男性16例，女性14例。3組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。受試者家屬對實驗已知情，并且簽字同意。

1.2 研究方法

采研究對象靜脈血4～5 ml，抗凝（EDTA），采取Ficoll密度梯度離心進行分離并提取患兒的外周血單個核細胞（PBMCs）。流式細胞術(shù)來檢測各組患兒的Th17細胞水平：調(diào)整PBMC細胞濃度為2×106/ml，1 ml 1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）于24孔板內(nèi)培養(yǎng)。其中加入PMA：50 ng/ml，Ionomycin：750 ng/ml，高爾基阻斷劑1 μl在溫度為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6 h，收集細胞到EP管內(nèi)，1500 r/min離心5 min，去上清，暗室內(nèi)用單抗抗人-CD3-PECy5，CD8-FITC室溫孵育20 min，表面染色后固定、破膜，用抗人-IL-17A-PE胞內(nèi)染色檢測Th17細胞的比例。Th17的檢測以相應(yīng)的同型IgG染色細胞作為陰性對照。采用熒光定量PCR檢測IL-23P19與RORrt基因mRNA表達，RORrt基因序列為F：5′-TCAGTCATGAGAACACAAATTGA-3′，R：5′GCACCCCTCACAGGTGATAA-3′；IL-23P19為F：5-′GGGAGATGAAGAGACTACAAATGATGT-3′，R：5′-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血PBMCs中Th17細胞占CD4+細胞百分率的比較

丙種球蛋白耐藥組外周血PBMC中Th17細胞占CD4+百分率為（1.286±0.616）%，明顯高于非丙種球蛋白耐藥組的（0.913±0.469）%及健康對照組的（0.549±0.416）%，且非丙種球蛋白耐藥組外周血PBMC中Th17細胞占CD4+百分率高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

與丙種球蛋白耐藥組比較，*P<0.05；與健康對照組比較，#P<0.05

2.2 3組IL-23P19與RORrt基因mRNA相對表達量的比較

丙種球蛋白耐藥組RORrt基因mRNA相對表達量高于非丙種球蛋白耐藥組及健康對照組，且非丙種球蛋白耐藥組高于健康對照組（P<0.05）；丙種球蛋白耐藥組IL-23P19基因mRNA相對表達量高于非丙種球蛋白耐藥組及健康對照組（P<0.05），但非丙種球蛋白耐藥組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3 討論

1967年在日本，川崎教授首次完整地描述并報道了川崎病，目前因為對川崎病的認識加深且?？梢约皶r地治愈鏈球菌感染等各種因素，川崎病的發(fā)病率已超越了兒童風(fēng)濕熱。相關(guān)資料表明，全球川崎病平均發(fā)病率是3.4/10萬～100/10萬，尤以日本最高，日本5歲以下的兒童其發(fā)病率達到驚人的100/10萬，而在北美洲的美國僅僅是10/10萬。男女發(fā)病比例是1.3∶1.7[3-5]。發(fā)病無明顯季節(jié)差異。川崎病最主要的并發(fā)癥為冠狀動脈損傷。通過使用大劑量的丙種球蛋白（IVIG），冠狀動脈病變的發(fā)生率可有效降低，然而在一些發(fā)達國家，并發(fā)癥冠狀動脈病變已成為一種最常見的小兒獲得性心臟病。在出現(xiàn)川崎病急性期后，會持續(xù)地存在冠狀動脈損害，這是導(dǎo)致患兒死亡的一個主要原因[6-7]，本研究結(jié)果顯示，川崎病患者外周血Th17細胞占CD4+細胞百分率明顯高于健康對照組（P<0.05），可認為Th17細胞在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中占主要作用；Th17細胞及IL-23P19與RORrt在丙種球蛋白耐藥型川崎病患者中的表達量比非丙種球蛋白耐藥型川崎病及健康對照組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），可認為增高的Th17可誘發(fā)各種炎癥因子釋放，促進丙種球蛋白耐藥型川崎病的血管損傷和炎癥反應(yīng)。

近年來已發(fā)現(xiàn)Th17細胞和Th1、Th2不同，能產(chǎn)生IL-17功能的又一群CD4+輔助性T細胞，能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與自身免疫性疾病、參與移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫，其在多種自身免疫性疾病、急慢性炎癥的調(diào)節(jié)軸中占有最中心地位[8-11]，如多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。Th17分泌的物質(zhì)主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具備強促炎作用，能與IL-17受體相結(jié)合，促進MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各種趨化因子、MMP的表達，能有效趨化單核細胞、中性粒細胞至炎癥部位，能介導(dǎo)組織滲透及損傷，還能刺激前列腺素E2、IL-6的產(chǎn)生及損傷內(nèi)皮細胞[6]。同時，其還可以與IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子協(xié)同作用而發(fā)揮增效作用，造成炎癥反應(yīng)的進一步加重。Th17細胞會通過分泌IL-17而作用不同的靶點細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生其他各種細胞因子，參與細胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，觸發(fā)釋放炎癥遞質(zhì)，進而有效地發(fā)揮生物效應(yīng)，表明Th17細胞確實在川崎病發(fā)病中參與作用，而其在丙種球蛋白耐藥型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究進一步通過檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病患兒Th17細胞、IL-23P19與RORrt的變化旨在進一步探討Th17、IL-23P19與RORrt在檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病的免疫發(fā)病機制中的意義，從細胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17、IL-23P19與RORrt細胞表達與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供理論依據(jù)，從而減少川崎病患兒冠狀動脈損害及心臟損害的后遺癥，保護兒童身心健康。

[參考文獻]

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[11] 王國兵，溫鵬強，王勤，等.急性期川崎病患兒調(diào)節(jié)性B細胞改變及意義初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文編輯：李亞聰）

近年來已發(fā)現(xiàn)Th17細胞和Th1、Th2不同，能產(chǎn)生IL-17功能的又一群CD4+輔助性T細胞，能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與自身免疫性疾病、參與移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫，其在多種自身免疫性疾病、急慢性炎癥的調(diào)節(jié)軸中占有最中心地位[8-11]，如多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。Th17分泌的物質(zhì)主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具備強促炎作用，能與IL-17受體相結(jié)合，促進MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各種趨化因子、MMP的表達，能有效趨化單核細胞、中性粒細胞至炎癥部位，能介導(dǎo)組織滲透及損傷，還能刺激前列腺素E2、IL-6的產(chǎn)生及損傷內(nèi)皮細胞[6]。同時，其還可以與IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子協(xié)同作用而發(fā)揮增效作用，造成炎癥反應(yīng)的進一步加重。Th17細胞會通過分泌IL-17而作用不同的靶點細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生其他各種細胞因子，參與細胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，觸發(fā)釋放炎癥遞質(zhì)，進而有效地發(fā)揮生物效應(yīng)，表明Th17細胞確實在川崎病發(fā)病中參與作用，而其在丙種球蛋白耐藥型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究進一步通過檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病患兒Th17細胞、IL-23P19與RORrt的變化旨在進一步探討Th17、IL-23P19與RORrt在檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病的免疫發(fā)病機制中的意義，從細胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17、IL-23P19與RORrt細胞表達與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供理論依據(jù)，從而減少川崎病患兒冠狀動脈損害及心臟損害的后遺癥，保護兒童身心健康。

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[10] 晏萍蘭，李萍.靜脈注射丙種球蛋白治療小兒川崎病不良反應(yīng)觀察與護理[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（8）：1366-1368.

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（收稿日期：2014-06-30 本文編輯：李亞聰）

近年來已發(fā)現(xiàn)Th17細胞和Th1、Th2不同，能產(chǎn)生IL-17功能的又一群CD4+輔助性T細胞，能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與自身免疫性疾病、參與移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫，其在多種自身免疫性疾病、急慢性炎癥的調(diào)節(jié)軸中占有最中心地位[8-11]，如多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。Th17分泌的物質(zhì)主要有IL-17A、IL-22、IL-17F等，其中IL-17A具備強促炎作用，能與IL-17受體相結(jié)合，促進MCP-1、TNF-α、CCX、MIP-2等各種趨化因子、MMP的表達，能有效趨化單核細胞、中性粒細胞至炎癥部位，能介導(dǎo)組織滲透及損傷，還能刺激前列腺素E2、IL-6的產(chǎn)生及損傷內(nèi)皮細胞[6]。同時，其還可以與IL-1β、TNF-α等其他炎癥因子協(xié)同作用而發(fā)揮增效作用，造成炎癥反應(yīng)的進一步加重。Th17細胞會通過分泌IL-17而作用不同的靶點細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生其他各種細胞因子，參與細胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，觸發(fā)釋放炎癥遞質(zhì)，進而有效地發(fā)揮生物效應(yīng)，表明Th17細胞確實在川崎病發(fā)病中參與作用，而其在丙種球蛋白耐藥型川崎病中的作用目前仍不甚清楚。

本研究進一步通過檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病患兒Th17細胞、IL-23P19與RORrt的變化旨在進一步探討Th17、IL-23P19與RORrt在檢測丙種球蛋白耐藥型川崎病的免疫發(fā)病機制中的意義，從細胞學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)全面地探討Th17、IL-23P19與RORrt細胞表達與丙種球蛋白耐藥型川崎病發(fā)病的相關(guān)性，為丙種球蛋白耐藥型川崎病的診治及預(yù)后提供理論依據(jù)，從而減少川崎病患兒冠狀動脈損害及心臟損害的后遺癥，保護兒童身心健康。

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[4] 陳婧，馬彬，林麗星，等.不同劑量丙種球蛋白治療川崎病的療效的Meta分析[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2011，13（8）：638-643.

[5] 樸金花，金蓮花，孫景輝，等.大劑量靜脈注射丙種球蛋白無反應(yīng)性川崎病的臨床分析[J].臨床兒科雜志，2009，27（5）：480-483.

[6] 張慶，李曉靜.川崎病的治療現(xiàn)狀[J].心血管病學(xué)進展，2010，31（5）：766-769.

[7] 丁艷，尹薇，熊越華，等.川崎病患兒免疫功能的檢測及臨床價值[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2012，16（9）：588-592.

[8] 韓云坤，孫冰，李麗紅，等.川崎病T細胞免疫及細胞因子變化的研究[J].中國實驗診斷學(xué)，2011，15（9）：1533-1536.

[9] 王從軍，陳梅，雷中勁，等.川崎病患兒細胞免疫功能狀況及轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的調(diào)控作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（4）：733-737.

[10] 晏萍蘭，李萍.靜脈注射丙種球蛋白治療小兒川崎病不良反應(yīng)觀察與護理[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（8）：1366-1368.

[11] 王國兵，溫鵬強，王勤，等.急性期川崎病患兒調(diào)節(jié)性B細胞改變及意義初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（10）：750-755.

（收稿日期：2014-06-30 本文編輯：李亞聰）