徐海聲 張 娟

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，在目前臨床實(shí)踐中乳腺癌預(yù)后評(píng)估主要來(lái)自于腫瘤的病理分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及激素受體的表達(dá)情況，但仍有20%～30%被認(rèn)為預(yù)后良好的乳腺癌患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)［1］。新輔助化療是目前局部晚期乳腺癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案［2］。本研究以乳腺癌組織異性基因hMAM為標(biāo)志，以RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)觀察局部晚期乳腺癌患者新輔助化療前后外周血微轉(zhuǎn)移的變化，探討其與化療之間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2009年12月至2012年12月女性乳腺癌患者45例，年齡36～74歲，平均(47.2±11.4)歲。臨床表現(xiàn)為乳腺腫塊40例，腫塊的最大直徑為1.0～4.0 cm;表現(xiàn)為乳頭單孔溢血5例?；颊?2例術(shù)前常規(guī)病理檢查確診為乳腺癌，13例術(shù)中快速病理切片顯示為乳腺癌?；颊呷虢M條件:①外周血、心肺肝腎功能、尿常規(guī)正常。②無(wú)過(guò)敏體質(zhì)及免疫缺陷。③所有患者經(jīng)B超、胸片及骨掃描檢查均有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。④所有患者就診前均接受過(guò)其他輔助性治療。另選健康體檢人群20例作為對(duì)照。

1.2 治療方法

患者按照TA方案行新輔助化療，具體方案:第1天，表阿霉素60 mg/m2，靜脈滴注;第2天，多帕菲，100 mg/m2，靜脈滴注?；?1天為1個(gè)周期?；颊哂谛螺o助化療前、化療1個(gè)周期后3天及2個(gè)周期后3天抽取靜脈血測(cè)定hMAM mRNA的表達(dá)情況。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)

參考hMAM基因庫(kù)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中引物序列:R為5c-GGGCAGACCTATTA-CATTC-3c，L為5c-GTGCTGG-GATTATAGGTG-3c;GAPDH的引物為5c-CTCAGACACCAT-GGGGAAGGTGA-3c和5c-ATGATCTTGAGGCTGTT-GTCATA-3c。采用Trizol法提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈。反應(yīng)條件，MgCl25 mmol/L，10 × 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 μl，dNTP 1 mmol/L，逆轉(zhuǎn)錄酶15 U，使用核酸酶抑制劑0.5 U，Oligo(dT)15 引物 0.5 μg，模板 RNA1 μg，加到無(wú) RNase水至終體積20 μl，42℃下反應(yīng)1 h，99℃下加熱5 min，然后快速冷卻到4℃，逆轉(zhuǎn)錄所取得的cDNA作為PCR反應(yīng)模板。逆轉(zhuǎn)錄后行PCR擴(kuò)增，取10 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透視儀下觀察結(jié)果。RT-PCR結(jié)果根據(jù)電泳條帶亮度以及內(nèi)參相對(duì)比值進(jìn)行判斷。

1.4 療效評(píng)估

收集乳腺癌患者相關(guān)臨床病理參數(shù)，按照實(shí)體瘤近期的療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)將療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)。其中治療有效為CR+PR，無(wú)效為SD+PD，化療有效的患者在化療后14～21 d擇期手術(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，其中P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hMAM mRNA在不同乳腺組織中的表達(dá)情況對(duì)比

RT-PCR檢測(cè)顯示乳腺癌患者中hMAM mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為62.2%(28/45)，顯著高于對(duì)照組的0，P＜0.05。

2.2 新輔助化療療效

本組45例患者均給予新輔助化療治療，經(jīng)過(guò)2個(gè)周期治療后，PR為25例，SD為18例，PD 2例。治療有效率為55.6%。新輔助化療前后外周血hMAM表達(dá)變化顯示，化療1周、2周后PR組的hMAM表達(dá)指數(shù)顯著低于SD+PD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，表明乳腺癌患者h(yuǎn)MAM表達(dá)越高預(yù)后越差，見(jiàn)表1。

表1 新輔助化療前后外周血hMAM表達(dá)變化情況

2.3 乳腺癌外周血hMAM陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

乳腺癌外周血hMAM陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性研究顯示，hMAM陽(yáng)性表達(dá)與TNN分期及ER的陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌外周血hMAM陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

3 討論

新輔助化療早期作為失去手術(shù)機(jī)會(huì)的局部進(jìn)展期乳腺癌患者的一種替代治療手段，部分患者通過(guò)新輔助化療充分降低了分期，使手術(shù)切除變成可能。乳腺癌患者死亡的主要原因?yàn)榱馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移。乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前就會(huì)發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。歐洲一項(xiàng)涉及4 703例乳腺癌患者的薈萃分析顯示，最初診斷時(shí)微轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)率高達(dá)30.6%，表明乳腺癌的血液轉(zhuǎn)移要早于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［3］。微轉(zhuǎn)移的發(fā)生提示乳腺癌患者預(yù)后不良。

外周血是一個(gè)理想的微轉(zhuǎn)移檢測(cè)標(biāo)本，從技術(shù)角度上說(shuō)外周血采血相對(duì)簡(jiǎn)單方便、容易接受、無(wú)創(chuàng)傷，而且可以反復(fù)采集，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)了解腫瘤細(xì)胞變化的目的［4］。外周血檢測(cè)到腫瘤擴(kuò)散能夠預(yù)示著早期發(fā)生全身轉(zhuǎn)移的可能性，直接影響患者療效及預(yù)后。轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞特異性基因標(biāo)志物檢測(cè)能夠?yàn)樵缙谥委熀秃Y查微轉(zhuǎn)移提供重要的參考［5］。外周血檢測(cè)到的乳腺組織粘附蛋白及特異性蛋白能夠早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌的播散細(xì)胞，有學(xué)者采用MUC-1、CK19等多種分子標(biāo)志物以期檢測(cè)出乳腺癌的播散細(xì)胞，并分析其陽(yáng)性表達(dá)對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)效果 ，然而這些標(biāo)志物表達(dá)多特異性不高。

hMAM是Fleming和Watson利用差式篩選及cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)分離到的新型乳腺組織特異性的基因，hMAM mRNA在正常乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)較低，在乳腺癌組織中表達(dá)相對(duì)較高［8］。

Ignatiadis等［9］采用 RT-PCR技術(shù)對(duì)早期乳腺癌患者中的HER-2、CK19、hMAM mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示輔助化療前外周血hMAM mRNA陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者無(wú)病生存期較短。本組研究RT-PCR結(jié)果顯示健康志愿者血清中未檢測(cè)到hMAM mRNA。而乳腺癌患者中hMAM mRNA陽(yáng)性表達(dá)占62.2%，表明陽(yáng)性表達(dá)hMAM mRNA在乳腺癌患者中存在著高表達(dá)。且病理相關(guān)性研究中顯示hMAM陽(yáng)性表達(dá)與TNN分期及ER的陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)。在新輔助化療的相關(guān)性研究當(dāng)中，本組研究發(fā)現(xiàn)化療1周、2周后PR組的hMAM表達(dá)指數(shù)顯著低于SD+PD組，結(jié)果對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05，表明乳腺癌患者預(yù)后越差，hMAM表達(dá)越高。

綜上所述，hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中有特異性的表達(dá)，為臨床檢測(cè)及制定乳腺癌微轉(zhuǎn)移的治療路徑提供了參考，具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值。

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