李 娜 矯 健 姜素云 竇德強

1.大連市食品藥品檢驗所,遼寧大連 116021; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連 116000

常常用亢進或低下來描述機體的免疫功能，對于機體來說亢進、低下都是有害的。人的身體健康與否，取決于機體的免疫功能是否能達到免疫功能的相對平衡，即保持相對的自身穩(wěn)定。該文綜述了目前國內(nèi)外對免疫藥物功能檢驗的一些方法，以期為免疫藥物的進一步研究和質(zhì)量控制提供參考。

1 免疫器官功能測定

小鼠稱重，取胸腺、脾臟，稱濕重，計算臟器指數(shù)，根據(jù)胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是否升高來判定受試物對機體免疫的調(diào)節(jié)能力[1]。

2 細胞免疫功能測定

2.1 MTT法

1983年Mosmann[2]用MTT顯色反應(yīng)法檢測細胞增殖細胞中線粒體內(nèi)酶還原MTT形成蘭紫色的甲臜，甲臜的量與細胞增殖程度呈一定關(guān)系，此法簡便、快速、準(zhǔn)確但是不夠穩(wěn)定。1994年，董德平等[3]對MTT比色法的條件進行了探討，發(fā)現(xiàn)甲臜溶解劑易引起蛋白沉淀，得出DMSO是一種較為理想的甲臜溶解劑。2000年，趙承彥等[4]對MTT法顯色條件進行了分析，認為MTT反應(yīng)體系在pH值為6.7，F(xiàn)ormazan溶劑是正丙醇、異丙醇和乙二醇乙醚時有很好的靈敏性和穩(wěn)定性。去掉細胞培養(yǎng)上清，檢測細胞上的酶，用溶劑使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)沉淀去掉蛋白質(zhì)影響，能使MTT實驗方法的本底降低，也可以提高靈敏度MTT比色法無需特殊儀器，且操作簡便快速準(zhǔn)確，國內(nèi)外大多采用該法。

2.2 同位素摻入法

同位素摻入法原理是有絲分裂原PHA、ConA等刺激T淋巴細胞產(chǎn)生增殖反應(yīng)，明顯增加DNA和RNA合成，如將H3-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)加入到培養(yǎng)液中,則可被轉(zhuǎn)化中的細胞攝入，淋巴細胞增殖的程度可由測定標(biāo)記淋巴細胞的放射強度反映出[5]。原材料成本高，設(shè)備價格高，且易對環(huán)境造成污染是此方法的缺點。徐淑云[6]報道了MTT比色法與3H-TdR滲入法兩法比較試驗表明，兩種方法平行相關(guān)，MTT比色法具有簡單、快速、敏感的優(yōu)點。但是MTT方法只能檢測已形成的細胞,而同位素標(biāo)記法能檢測細胞形成的初期即DNA合成的啟動階段,結(jié)果準(zhǔn)確[7]。

2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)

70年代初期，有學(xué)者[8-9]用特異抗原誘導(dǎo)測定腳掌或耳腫脹來表示DTH。后來，Hartley[10]提出了用綿羊紅細胞抗原致敏，然后在尾中部皮下進行攻擊注射，通過測定尾部腫脹程度來表示DTH，該法有較高的重復(fù)性和可靠性?，F(xiàn)在多數(shù)實驗[6]都用1%丙酮麻油致敏，5 d后，測耳腫脹度來表示DTH。DTH實驗方法簡便，但是在實驗過程中，致敏范圍和打孔位置是否一致，對實驗的結(jié)果有影響。

3 體液免疫功能測定

3.1 抗體生成細胞檢測

1963年，Jerne[11]首先建立了溶血空斑實驗。1964年，Ingraham和Bussard[12]利用半固體介質(zhì)將其改良成瓊脂與致甲基纖維素溶血空斑平板法。1965年，Cunningham等[13]利用載玻片制作小室改良成單片玻片小室溶血空斑法。1973年，Sulitzeam和Marbrook[14]發(fā)現(xiàn)了瓊脂或瓊脂糖溶血空斑玻片法。1975年，Simpson和Gozzo[15]根據(jù)溶血空斑原理將其改良成淋巴介導(dǎo)紅細胞的分光光度法，將免疫脾細胞(對照用正常脾細胞)，SRBC和補體在液相介質(zhì)中進行反應(yīng)，觀察紅細胞被抗體生成細胞產(chǎn)生的IgM所裂解，而釋放的血紅蛋白量，用分光光度計作定量測定，據(jù)此推知抗據(jù)此推知抗體生成細胞多少。1976年，Gronwicz等[16]通過加入針對產(chǎn)生免疫球蛋白細胞供者的Ig的抗體，從而細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物上的Fc片段可與連接在SRBC上的SPA結(jié)合，同時激活補休使SRBC溶解形成空斑即葡萄球菌A蛋白—SRBC溶血空斑法。以上各種方法各有優(yōu)缺點，實驗者應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的方法。

3.2 血清溶血素的測定

血清溶血素的測定有血凝法和半數(shù)溶血值2種測定方法。血凝法用SRBC免疫動物后，抗SRBC抗體(溶血素)產(chǎn)生，利用其凝集SRBC的程度來對溶血素的水平進行檢測[5]。1979年，徐學(xué)瑛[17]報道了小鼠血清溶血素測定法。1999年，雷林生[18]等將含有溶血素的血清樣品適當(dāng)預(yù)稀釋,然后取100 μL加入96孔板中進行有限的倍比稀釋來測定小鼠血清溶血素的活性。該法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。半數(shù)溶血值(HC50)用SRBC免疫動物后，血清中出現(xiàn)SRBC抗體(溶血素)，發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映血清中溶血素的含量[5]。

4 巨噬細胞功能測定

4.1 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬細胞實驗

徐淑云介紹用新鮮雞紅細胞作為吞噬物，半體內(nèi)法測定小鼠吞噬功能。1989年，陳逐[19]又對其進行了改進，將雞紅細胞進行醛化并省去體內(nèi)孵育步驟，此法提高了吞噬率和實驗的穩(wěn)定性。后又有學(xué)者[20]在實驗前24h用淀粉刺激巨噬細胞滲出，并于注射臨時配制的雞紅細胞30 min后觀察實驗結(jié)果，也取得了良好的效果。但是巨噬細胞吞噬能力經(jīng)小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗檢測，需要操者顯微鏡下計數(shù)，存在效率低、工作量大、受主觀影響大的缺點。2009年，王輝等[21]又提出了腹腔巨噬細胞吞噬乳膠顆粒的試驗作為一種替代方法,與傳統(tǒng)方法比較可以減少雞紅細胞的使用,該法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。

4.2 流式細胞技術(shù)(FCM)

1982年Steinkamp首創(chuàng)熒光微球流式細胞術(shù)定量檢測吞噬功能。上世紀(jì)80～90年代期間，許多學(xué)者[24-26]用流式細胞儀檢測了中性粒細胞的吞噬功能。20年代初期,陳衛(wèi)國等[27]用綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染方法標(biāo)記大腸埃希菌,用于觀察PMN吞噬細菌動力學(xué),但該方法操作麻煩又不夠準(zhǔn)確。2002年，Gaforio等[28]用SYTOXGreen染料標(biāo)記大腸埃希菌,用流式細胞儀檢測PMN的吞噬功能，但是價格昂貴。2004年，趙修春[29]等用流式細胞術(shù)檢測小鼠PMN吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌，該法快速、簡便、重復(fù)性好。流式細胞儀方法一次獲取10 000個細胞,相比于鏡下肉眼觀察計數(shù)100個細胞,大為提高了檢測樣本的代表性,實驗結(jié)果的精度也更為可靠和保證。采用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞吞噬功能的方法不僅準(zhǔn)確、靈敏,更為重要的是它的高通量的特點使檢驗效率大大提高了,檢驗過程中人為主觀因素的影響減少了[30]。因此,無論是考慮方法的精確度、靈敏度,還是提高檢驗效率等因素,保健食品或相關(guān)物質(zhì)增強免疫力功能的評價采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒炗泻芎玫膽?yīng)用前景[31]。

5 單核-巨噬細胞功能測定

單核巨噬細胞系統(tǒng)是機體最重要的防御系統(tǒng),它吞噬某些可溶性異物或異體顆粒的能力強大而迅速,并能將體內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)迅速清除。保健食品檢驗和評價技術(shù)規(guī)范[5]中給予墨汁途徑為小鼠尾靜脈，但是由于小鼠尾靜脈細小及季節(jié)環(huán)境對小鼠影響較大，嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。有學(xué)者[22-23]認為通過小鼠內(nèi)眥靜脈注入墨汁，其操作簡單，成功率高。小鼠碳廓清實驗操作容易,初學(xué)者可很快掌握,不需特殊條件,易為一般實驗室所接受,為免疫調(diào)節(jié)劑的體內(nèi)試驗研究提供了較為穩(wěn)定而方便的方法。

6 NK細胞活性測定

6.1 同位素釋放法

自90年代以來，國內(nèi)外大都采用51Cr釋放試驗，該法靈敏度高，操作方便，測定迅速并且能夠定量分析，但51Cr具有半衰期短和放射性等缺點[32]。也有用125I-Udr釋放法，該法自然釋放率低但是需要酶處理且價格貴。目前使用較多的是3H-Tdr釋放法，該法突出的優(yōu)點是半衰期長，缺點是非特異標(biāo)記高及污染環(huán)境。

6.2 乳酸脫氫酶(LDH)測定法

1983年，KorzeniewskiC[33]報道了LDH釋放法，該法測定迅速準(zhǔn)確，自然釋放率低。又有學(xué)者[34]在原法的基礎(chǔ)上將它的效靶比、反應(yīng)時間和表面活性劑加以改進以利于LDH更好的應(yīng)用。20年代初期，劉家國[35]等提出了幾個影響NK細胞活性的主要因素，認為各實驗室之間統(tǒng)一檢測程序可提高結(jié)果的可比性。相比于免疫常用方法51Cr釋放法,LDH測定法具有不存在同位素污染和操作省時等優(yōu)點,但影響此法的因素較多，實際操作不易掌握[7]?，F(xiàn)在國內(nèi)大多采用乳酸脫氫酶釋放法，但表現(xiàn)出敏感性低的缺點,從而期待發(fā)展敏感、特異、安全、簡單、快捷的檢測細胞毒活性方法。

6.3 化學(xué)發(fā)光法

顧依平[36]報道對NK細胞殺傷腫瘤細胞前后ATP水平(表現(xiàn)為化學(xué)發(fā)光強度)的動態(tài)變化檢測應(yīng)用了蟲熒光素酶,借以對NK細胞的免疫活性進行檢測。

7 結(jié)語

免疫功能檢驗不能用簡單的理化分析與儀器分析的方法進行測定。目前所報道的諸多方法也是各有所長，在實際檢測中應(yīng)根據(jù)情況采用兩種或兩種以上的方法進行，以使研究結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠得到保證性。隨著人們對免疫藥物的不斷深入研究，檢測藥物對免疫系統(tǒng)的各種代表性指標(biāo)的改變可對增強免疫力作用的功能做出相應(yīng)判定。

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