溫成麗，職瑞娜，王玉柱，黃 超，李衛(wèi)華，丁訓(xùn)城

(1.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200032;2.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所國(guó)家計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

目前使用最廣泛的陰道殺精劑壬苯醇醚-9，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致陰道黏膜刺激癥狀并導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)感染增加，因此新型高效、低毒兼具抗精子特異性活性的外用避孕化合物不斷被發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外正在對(duì)這些活性化合物進(jìn)行抗精子靶標(biāo)和機(jī)制的研究［1］。

膽酸及其衍生物去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDC)是一類存在于人體膽汁中的天然的表面活性物質(zhì)。Courtot等［2］證實(shí)，它們具有殺滅精子作用，而且能抑制人免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)的復(fù)制，這類膽酸衍生物的細(xì)胞毒性較低，對(duì)人的腸黏膜細(xì)胞沒有任何損害作用。為進(jìn)一步提高藥效，降低副作用，在保留膽酸可能的藥效基團(tuán)的基礎(chǔ)上，對(duì)其側(cè)鏈部位用氨基酸進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，合成了新的膽酸衍生物去氧膽酰酪氨酸(deoxycholyltyrosine，DCT)，相對(duì)分子質(zhì)量558.0。DCT還具有較強(qiáng)的抗HIV-1活性，其 IC50為(21.50 ±3.2)mg·L－1，并可抑制 HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性［3］。也有研究報(bào)道，HIV病毒膜對(duì)DCT具有選擇性的吸收，聚集于富含磷脂的HIV磷脂雙分子層中，直接滅活HIV-1病毒［4］。至于DCT滅活人類精子，其抗精子靶標(biāo)和作用機(jī)制目前還未見報(bào)道。

為探索DCT滅活人類精子的生物學(xué)特征，本研究利用熒光染色劑與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合技術(shù)，從精子凋亡反應(yīng)及質(zhì)膜完整性(plasma membrane integrity，PMI)角度，對(duì)人類精子結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)特別是精子凋亡和質(zhì)膜完整性進(jìn)行檢測(cè)。在傳統(tǒng)顯微鏡檢查和CASA分析常規(guī)評(píng)估終點(diǎn)的基礎(chǔ)上，將DCT對(duì)精子藥效從定性描述轉(zhuǎn)化到定量的高通量多參數(shù)的分析，增加敏感特異的分子水平上的評(píng)價(jià)終點(diǎn)［5］，從而為下一步探討DCT對(duì)精子作用的候選靶標(biāo)以及設(shè)計(jì)新型外用避孕藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

精子培養(yǎng)液(Earle's balanced salt solution，EBSS);絡(luò)合異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)Becton Dickinson公司);LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L-7011)(美國(guó)Invitrogen Molecular Probes公司);碘化丙啶(PI，美國(guó)Sigma公司);DCT，本課題組合成。計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(北京清華同方股份有限公司);流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國(guó)BD公司);熒光顯微鏡(BX41，日本Olypus);低速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)。

1.2 精液標(biāo)本的采集

2012年12月－2013年4月就診于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所醫(yī)院門診部的男性，年齡25～35歲，禁欲3～8 d，自慰法收集精液，取符合WHO標(biāo)準(zhǔn)的正常精液(在0.5 h內(nèi)液化、精液量＞2 mL、pH值7.0 ～7.7、精子活率 ＞70%)用于本課題的研究。使用之前先用上游法進(jìn)一步獲得高活力精子，并將精子樣本調(diào)節(jié)至密度為1×1010L－1備用。本研究經(jīng)本研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，精液標(biāo)本捐獻(xiàn)者知情同意，標(biāo)本在完成實(shí)驗(yàn)后，全部高溫殺滅。避免多人精液混合精子出現(xiàn)凝集，實(shí)驗(yàn)采用同一人的精樣。

1.3 精子上游法獲得高活力精子

將符合WHO標(biāo)準(zhǔn)的精液標(biāo)本置于錐底離心管中，300 ×g 離心10 min，棄精漿，留0.2 ～0.4 mL沉淀精子液。取含8 mL EBSS(含0.4%牛血清白蛋白)的錐底離心管，將沉淀精子液小心加到EBSS液下方，并將試管傾斜40°置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。輕輕吸取試管上層呈云霧狀含精子的EBSS液約2 mL。在300×g離心3 min，棄上清。用0.5 mL EBSS液重懸精子沉淀團(tuán)，獲得高活力精子懸液，調(diào)節(jié)精子密度為1×109L－1。

1.4 精子活率與運(yùn)動(dòng)參數(shù)的測(cè)定

取50 μL高活力精液，分別置入DCT終濃度分別為0，0.25，0.50 和1.0 g·L－1的96 孔板中，混勻。20 min后分別吸取混合后的精子懸液約10 μL用CASA進(jìn)行分析，獲得精子活率和(a+b)級(jí)精子活力的檢測(cè)百分比。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)質(zhì)膜完整性

將高活力精子樣本用EBSS精子培養(yǎng)液調(diào)節(jié)密度為1×109L－1。取200 μL精子懸液分別置入含200 μL 37℃預(yù)溫的EBSS空白溶液和DCT溶液(濃度分別為 0.25，0.50 和 1.0 g·L－1)的1.5 mL離心管中。于37℃，5%CO2孵箱避光孵育20 min，300 × g 離心 5 min，棄上清，用 400 μL EBSS精子培養(yǎng)液重懸。取其中200 μL懸液放入1.5 mL離心管中，加入 SYBR-14(終濃度100 nmol·L－1)和PI(終濃度12 μmol·L－1)各1 μL，混勻后 37℃，5%CO2孵箱孵育 20 min，離心，棄上清。再用EBSS精子培養(yǎng)液清洗2次，300×g離心5 min，除去游離多余熒光染料。最后用400 μL EBSS液重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每份懸液樣本獲取10 000個(gè)精子。

1.6 熒光顯微鏡觀察質(zhì)膜完整性［6］

取1.5項(xiàng)SYBR-14/PI染色后的各組精子懸液10 μL涂于玻片上?？諝飧稍锖?，在400倍熒光顯微鏡下觀察。每張涂片計(jì)數(shù)200個(gè)精子，以綠色熒光精子占檢測(cè)精子百分率表示，計(jì)算檢測(cè)樣品精子質(zhì)膜完整率，以質(zhì)膜完整精子占檢測(cè)精子總數(shù)百分率表示。

1.7 AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞儀分析精子凋亡

按照1.5項(xiàng)將精子與DCT混合后，吸取其中200 μL EBSS 精子懸液，加入 AnnexinⅤ-FITC 和PI各10 μL，混勻，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱避光孵育20 min，300×g離心8 min，棄上清，用EBSS液洗滌2次。加入200 μL EBSS液重懸，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定染色情況。每份樣品記錄10 000個(gè)精子。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DCT對(duì)精子活率和活力的影響

DCT 0.25 g·L－1組精子活力和活率下降為空白對(duì)照組的1/2，DCT 0.50 g·L－1組活力和活率下降為空白對(duì)照的1/10 和1/20，1.0 g·L－1組幾乎無(wú)存活精子存在(表1)。不同濃度DCT對(duì)精子活率和活力均具有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且是精子活率及活力均顯示出隨著DCT濃度的增加而降低的趨勢(shì)(r活率=0.91，r活力=0.88，P ＜0.05)。

Tab.1 Effect of deoxycholyltyrosine(DCT)on sperm viability and motility

2.2 DCT對(duì)質(zhì)膜完整性的影響

2.2.1 流式細(xì)胞儀結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖1)及定量數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，空白對(duì)照組活精子百分率顯著高于DCT處理組(P＜0.05)。隨著DCT濃度的增加，死亡精子百分率，即質(zhì)膜破損精子百分率逐漸升高，DCT 0.25，0.5 和1.0 g·L－1時(shí)質(zhì)膜破損的死精子百分率分別 為 (54.3 ± 9.8)%，(73.8 ± 3.5)% 和(80.6±8.3)%，與空白對(duì)照組具有明顯差異(P＜0.05)，并具有較好的濃度依賴性(r=0.91，P ＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著DCT濃度的升高，質(zhì)膜損傷精子百分率逐漸升高，正常精子百分率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，DCT 0.50 g·L－1組瀕死精子百分率較高，隨著濃度升高瀕死精子質(zhì)膜逐漸被破壞成為壞死精子。

Fig.1 Effect of DCT on membrane integrity of human sperm by flow cytometry.See Tab.1 for the treatment.A:control group;B:DCT 0.25 g·L －1;C:DCT 0.5 g·L －1;D:DCT 1.0 g·L －1.

Tab.2 Effect of DCT on membrane integrity of human sperm

2.2.2 熒光顯微鏡觀察

熒光顯微鏡觀察顯示，DCT作用后精子分為3個(gè)亞群，質(zhì)膜完整的活精子呈邊緣光滑均勻淡染的綠色熒光，為SYBR-14陽(yáng)性染色(圖2A);而死亡精子的質(zhì)膜受損，染色劑PI進(jìn)入精子內(nèi)部與核染色，使之呈現(xiàn)均勻彌漫的紅色熒光，為PI陽(yáng)性染色(圖2D);同時(shí)，染上并發(fā)出2種熒光的雙陽(yáng)性機(jī)子，正處于從活向死的過渡狀態(tài)(圖2B，C)。

Fig.2 EffectofDCT on membrane integrity by fluorescence microscopy(×400).See Tab.1 for the treatment.A:control group;B:DCT 0.25 g·L －1;C:DCT 0.5 g·L －1;D:DCT 1.0 g·L －1.

2.4 DCT對(duì)人精子凋亡的影響

圖3及各象限數(shù)據(jù)結(jié)果(表3)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，DCT 0.5 g·L－1使精子的早期凋亡率升高到(9.7 ±0.7)%(P ＜0.05)，濃度為 1.0 g·L－1時(shí)，其早期凋亡率反而下降至(2.4±0.9)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明DCT對(duì)精子早期凋亡率具有雙向性。DCT 0.25，0.5 和1.0 g·L－1各組的人精子晚期凋亡率均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.98，P ＜0.01)。

Fig.3 Effect of DCT on sperm apoptosis by AnnexinⅤ-FITC/PI staining.See Tab.1 for the treatment.A:control group;B:DCT 0.25 g·L －1;C:DCT 0.5 g·L－1;D:DCT 1.0 g·L －1.

Tab.3 Effect of DCT on apoptosis of human sperm

3 討論

本研究顯示，DCT對(duì)精子具有明顯的殺傷作用，可望作為新型外用避孕藥進(jìn)行研發(fā)。隨著DCT濃度的升高，精子活力、活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。質(zhì)膜完整性檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著DCT濃度的升高，存活精子比例逐漸降低，死亡精子比例逐漸升高。DCT≤0.5 g·L－1引起精子早期凋亡率升高，但是高濃度時(shí)卻出現(xiàn)降低趨勢(shì)。精子晚期凋亡率隨著濃度的升高呈現(xiàn)明顯增高的趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，DCT 1.0 g·L－1可使精子的活力為0，不存在具有生殖能力的a級(jí)和b級(jí)精子。精子活率此時(shí)為(0.2±0.5)%，這主要是由活力較差的c級(jí)精子組成，其活力已不能夠達(dá)到受精的要求。這一結(jié)果顯示，DCT與現(xiàn)在市售的具有陰道刺激性的壬苯醇醚-9的殺精效能(最低殺精濃度0.35 g·L－1［7］)相似。

精子質(zhì)膜是精子最外層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，用以維持和調(diào)節(jié)胞內(nèi)成分，其結(jié)構(gòu)與生理的完整性對(duì)維持精子存活、運(yùn)動(dòng)和生化代謝是十分重要的［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DCT作用后質(zhì)膜完整精子比例逐漸下降，質(zhì)膜破損精子比例不斷上升，提示DCT對(duì)精子的質(zhì)膜具有明顯的損傷作用。瀕死精子比例不具有明顯的濃度依賴性，這可能是因?yàn)殡S著DCT濃度升高，瀕死狀態(tài)的精子逐漸死亡，從而使得死亡精子比例升高有關(guān)。

凋亡不僅發(fā)生于睪丸生精上皮中的生精細(xì)胞，也可以發(fā)生在精子水平，但過度的凋亡可能是導(dǎo)致精子的受精能力下降的原因之一［9］。AnnexinⅤ檢測(cè)精子凋亡結(jié)果表明，DCT處理組的精子晚期凋亡及壞死率均隨濃度增高而升高，且具有濃度-效應(yīng)關(guān)系。

DCT誘發(fā)人類精子凋亡，且以晚期凋亡增高為特點(diǎn)，且與精子質(zhì)膜完整性實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，可能是隨著DCT濃度升高，精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變異加劇破損，膜滲透性增高，由早期凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥诘蛲黾皦乃谰樱浠盍褪芫芰Ρ厝粏适?，最后引起精子死亡。焦立飛等［10］認(rèn)為，此凋亡可能與過自殺受體(Fas/FasL)途徑或線粒體途徑激活胱天蛋白酶，并作用到下游的酶切底物，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡有關(guān)。綜上所述，DCT一類化學(xué)因素以濃度依賴性方式誘發(fā)精子“過度”凋亡而導(dǎo)致精子受精能力喪失。且均與精子質(zhì)膜完整性、通透性和穩(wěn)定性密切相關(guān)。

本研究采用定性和定量相結(jié)合的方法研究DCT對(duì)精子質(zhì)膜和凋亡的影響，雖然采用多次實(shí)驗(yàn)的方法控制隨機(jī)誤差，但是鑒于機(jī)器對(duì)于聲音和振動(dòng)的敏感性，本實(shí)驗(yàn)活力和活率數(shù)據(jù)可能存在誤差。另外，精子的凋亡受到多種基因的控制，應(yīng)進(jìn)一步探討DCT作用于精子凋亡的線粒體途徑及其相關(guān)調(diào)控基因如Fas/FasL和Bcl-2/Bax的表達(dá)。因此，DCT誘導(dǎo)致人類精子細(xì)胞凋亡的機(jī)制還有待于繼續(xù)深入研究。

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