馬婧怡，張萬鑫，陳 虹，丁 慧，劉春麗，金曉敏

(石河子大學(xué)藥學(xué)院教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室，新疆石河子 832002)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指腦血管病變引起腦損害后所導(dǎo)致的癡呆，以記憶、認(rèn)知功能缺損為主，同時還伴有語言、運動、視空間障礙以及人格障礙［1］。是目前為止唯一可以防治的癡呆，如果能夠早期發(fā)現(xiàn)并積極防治有逆轉(zhuǎn)的可能性［2］。目前VD的研究已成為醫(yī)藥學(xué)界諸多學(xué)者關(guān)注的重點，因而制作理想的動物模型對探究VD的發(fā)病機制及新藥開發(fā)至關(guān)重要。既往許多學(xué)者曾采用各種腦缺血模型進行VD模型的制作，包括最為經(jīng)典的雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法，國際公認(rèn)的VD造模方法:pulinsin-四血管阻斷法，雙側(cè)頸總動脈缺血再灌注法，栓塞法以及復(fù)合VD造模方法等。其中栓塞法又包括光化學(xué)誘導(dǎo)栓塞法、線栓法、微血栓顆粒造模法(血凝塊栓子栓塞法)、顱外安置小磁鐵吸附經(jīng)尾靜脈注入四氧化三鐵的方法。復(fù)合VD模型的建立包括高血壓加雙側(cè)頸動脈缺血再灌注血管性癡呆模型、高血脂加四血管阻斷法制作VD模型［3］。諸多模型都各有其優(yōu)缺點，因此，應(yīng)當(dāng)針對研究內(nèi)容及所需重點選擇出更為合適的建模方法。本實驗采用兩種改良后的成熟方法制作VD模型，旨在探討比較該兩種改良方法制備的VD模型的成?？尚懦潭取楹笃谶M一步深入研究防治VD的藥物奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及儀器

水合氯醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，多聚甲醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號:20060714)，HM-202型十萬分之一天平(日本A＆G有限公司)，DMS-2型Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);CM3050型恒溫冰凍切片機(德國Leica公司);MIC0266型倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.2 動物及模型制備

36只雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量250～350 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心，許可證編號SCXK(新)2011-0002。隨機分為不同時點永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總(改良2-VO)、改良大鼠大腦中動脈梗死/再灌注(改良MCAO/R)、假手術(shù)組，每組12只。

1.2.1 改良2-VO模型制備

采用不同時點永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總(改良2-VO)的方法［4］，即采用每間隔3 d分2次永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈法制備模型。

1.2.2 改良MCAO/R模型制備

采用左側(cè)切口、不分離翼腭動脈等改良手段制備改良大鼠大腦中動脈梗死模型［5］，并將栓線尾部略露出皮膚，縫線略作固定。在栓線置入2 h后再次麻醉大鼠，由露出皮膚的栓線尾部將栓線柔和緩慢地抽出，當(dāng)栓線前端膨大處遇到頸外動脈(ECA)結(jié)扎線時會有阻力，即停止拔線，剪除栓線的殘余末端，完成改良MCAO/R模型制備。

假手術(shù)組只分離大鼠雙側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，但不做任何結(jié)扎及魚線插入，其余步驟縫合傷口，每日碘伏消毒。

1.3 Morris水迷宮實驗

根據(jù)文獻［4］，參照Morris實驗方法進行，于術(shù)后第15天開始。實驗歷時7 d，訓(xùn)練第1天(術(shù)后第15天)讓大鼠自由游泳2 min;從第2天(術(shù)后第16天)起，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)自動記錄大鼠找尋并爬上平臺時所需時間(逃避潛伏期)及運動軌跡，每次訓(xùn)練間隔為60 s。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為120 s。于訓(xùn)練第7天(術(shù)后第21天)撤除水下平臺，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)將自動記錄其在120 s內(nèi)跨過原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)及運動軌跡。于術(shù)后第41天及第42天，同上述操作，再次觀察各組大鼠的逃避潛伏期及平臺穿越表現(xiàn)。

癡呆標(biāo)準(zhǔn)是以實驗組大鼠的各時段成績的平均逃避潛伏期與假手術(shù)組逃避潛伏期的均值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比例來判定的。該值＞20%為癡呆大鼠［6］。其中，若該值＞20%≤30%為輕度癡呆，＞30%≤40%為中度癡呆，＞40%為重度癡呆。

游泳軌跡靠通過觀察動物入水后尋找平臺來確定。隨機式的搜索軌跡往往出現(xiàn)在水迷宮大部分區(qū)域，帶有很大的盲目性;邊緣式是一種沿池壁以大幅度軌跡搜索平臺的方式，這是一種本能行為，處于較低級的認(rèn)知水平;趨向式是以曲線逐步向平臺靠攏，是一種較高級的策略，但定位不夠準(zhǔn)確;直線式為從起點以直線方式向平臺搜索，表明有明確的空間定位。通過記錄各組大鼠在水迷宮實驗期間每天第一次入水時所采用的搜索策略方式，計算出各組搜索策略方式為直線式和趨向式的大鼠個數(shù)之和進行統(tǒng)計分析。

1.4 HE染色觀察大鼠海馬組織CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)的變化

水迷宮實驗結(jié)束后第2天，大鼠ip給予10%水合氯醛(3.5 mL·kg－1)麻醉迅速斷頭取腦，去掉嗅腦、小腦及低位腦干，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分，將腦組織置于4%多聚甲醛中浸置4～6 h(4℃)。

將多聚甲醛浸置后的腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每張切片厚約5 μm，進行HE染色在倒置熒光相差顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 改良模型大鼠逃避潛伏期表現(xiàn)

表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，兩模型組逃避潛伏期均延長(P ＜0.05，P ＜0.01)，尤以改良2-VO組的逃避潛伏期最長，改良MCAO/R組次之，而改良MCAO/R組到術(shù)后第41天與假手術(shù)組已無顯著性差異。

自術(shù)后第19天(水迷宮定位航行實驗進行第4天)起，改良MCAO/R組與改良2-VO組逃避潛伏期出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，2-VO組顯著延長，直至術(shù)后第41天，顯著性差異最為明顯(P＜0.01)。

Tab.1 Escape latency of rats in improved permanent bilateral common carotid artery occlusion(2-VO)and improved middle carebral artery occulsion(MCAO/R)models

與同組術(shù)后第41天潛伏期相比，假手術(shù)組自實驗進行第4天起趨于平穩(wěn)(P＞0.05)，而兩模型組均與術(shù)后第41天形成顯著性差異;與術(shù)后第41天比較，術(shù)后第20天延長，改良MCAO/R組顯著延長(P ＜0.01)，改良2-VO 組次之(P ＜0.05)。

術(shù)后72 h內(nèi)，改良2-VO組中有1只大鼠，死于呼吸困難;改良MCAO/R組共有3只動物死亡，其中1只死于呼吸困難，2只于拔栓線后死亡，假手術(shù)組大鼠無死亡。結(jié)合潛伏期數(shù)據(jù)，計算可知，術(shù)后41d時，改良2-VO組癡呆大鼠10只，其中2只為輕度癡呆，7只為中度癡呆，1只為重度癡呆。改良MCAO/R組癡呆大鼠7只，其中3只為輕度癡呆，2只為中度癡呆，2只為重度癡呆。

2.2 改良模型大鼠平臺穿越表現(xiàn)

表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，兩模型組穿越平臺次數(shù)均減少，尤以改良2-VO組最為突出。術(shù)后第21天，2-VO和MCAO/R組穿越次數(shù)顯著減少(P＜0.01)，并且2-VO組顯著低于MACO/R組(P＜0.01);術(shù)后第42天，2-VO組穿越次數(shù)依舊顯著低于假手術(shù)組，但MACO/R組已恢復(fù)至假手術(shù)組水平。

Tab.2 Number of crossing platform of rats in improved 2-VO and improved MCAO/R models

2.3 改良模型大鼠游泳軌跡表現(xiàn)

通過攝像頭記錄軌跡，各組以趨向式及直線式為搜索策略的大鼠個數(shù)之和如下表3所示。其中假手術(shù)組大鼠的游泳軌跡多為趨向式和直線式，對空間方向的辨別力較高;而改良2-VO組游泳軌跡多為邊緣式和隨機式，對空間方向辨別力很低;改良MCAO/R組從水迷宮航行實驗進行第4天起，搜索策略大部分改變。通過χ2檢驗可知，從水迷宮航行實驗進行第3天(術(shù)后第18天)起，每天的χ2值分別是 7.020;8.440;9.812;10.451;13.124 和14.470，且均 P ＜0.05。

Tab.3 Total number of tendencies and linear strategies of improved 2-VO and improved MCAO/R models

2.4 改良模型大鼠海馬組織CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)變化

HE 染色后，兩模型組(圖1A，1B，1C，1D)的大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞排列紊亂稀疏，細(xì)胞形態(tài)不完整，結(jié)構(gòu)不正常，胞漿稀少，胞核與胞漿界限模糊，細(xì)胞核深染，固縮呈三角形或不規(guī)則形，核仁不明顯，并出現(xiàn)增生膠質(zhì)細(xì)胞。尤以改良2-VO組(圖1A，1B)最為嚴(yán)重，改良MCAO/R組(圖1C，1D)次之;假手術(shù)組(圖1E，1F)大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)目多，排列整齊緊密，細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，胞核與胞漿界限清晰可見，核仁明顯。

Fig.1 Morphological changes of hippocampus CA1 area of improved model rats(HE staining).A:improved 2-VO group(×200);B:improved 2-VO group(×400);C:improved MCAO/R group(×200);D:improved MCAO/R group(×400);E:sham group(×200);F:sham group(×400).Arrows show proliferative glial cells and incomplete cells.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，兩模型組學(xué)習(xí)記憶能力顯著性下降，至術(shù)后第41天改良2-VO組仍具有明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降現(xiàn)象，而改良MCAO/R組在20 d時學(xué)習(xí)記憶能力確實有下降現(xiàn)象，但至術(shù)后第41天該現(xiàn)象已消失，這說明該組大鼠記憶能力顯著提高，空間探索及搜索策略結(jié)果也再次證實這一點。同時通過各組訓(xùn)練的每一天與同組術(shù)后第41天的潛伏期比較可看出除假手術(shù)組于訓(xùn)練后第4天起成績趨于平穩(wěn)外，兩模型組均有學(xué)習(xí)記憶能力提高的現(xiàn)象，可能是由于術(shù)后隨時間的增加大鼠自身的修復(fù)所造成。而值得注意的是，同組間的術(shù)后第21天與第42天穿越平臺次數(shù)比較中，僅有改良MCAO/R組出現(xiàn)顯著性差異，這與潛伏期所得結(jié)果不一致。分析原因可能是由于潛伏期的計算是將每只大鼠的每天上下午兩段，共8次潛伏期求平均，中間摻雜了瞬時記憶的影響。而空間探索則是在所有訓(xùn)練后第一次入水的記憶能力體現(xiàn)，更具代表性，但這需要進一步的實驗證實。針對目前結(jié)果而言，能夠證實的是雖然兩模型組均有自我修復(fù)過程，但改良2-VO組的程度遠小于改良MCAO/R組，或者說在術(shù)后42 d內(nèi)這種修復(fù)能力對于模型成功與否的影響是很小的，而改良MCAO/R組卻因為這種修復(fù)而導(dǎo)致隨時間的推移，模型逐漸不成立。

以改良2-VO法導(dǎo)致癡呆的大鼠，在結(jié)扎術(shù)后42 d學(xué)習(xí)記憶能力仍無恢復(fù)趨勢，這將有利于藥物療效的長期動態(tài)觀察，該模型是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能下降、學(xué)習(xí)記憶功能障礙，較好地模擬了人因動脈粥樣硬化、動脈管腔狹窄等因素導(dǎo)致的VD，且手術(shù)過程簡單易行，相對穩(wěn)定。但僅結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，由于大腦動脈環(huán)的代償作用，側(cè)支循環(huán)的建立，難以達到理想的腦缺血。

改良MCAO/R法制作的模型具有明確缺血灶［7］，成型時長短，可重復(fù)性強的特點。但隨著時間的延長，其大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有顯著性恢復(fù)。這是由于再灌注模型主要是腦的急性缺血再灌注損傷所致，沒有雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后的長期低灌注缺血的影響，雖然在造模后的20 d內(nèi)時與假手術(shù)組比較具顯著性差異，至42 d卻已無明顯差異，腦功能恢復(fù)較為明顯，該結(jié)論與以前文獻報道相符［8］，且大鼠栓塞性腦缺血再灌注與人群常見的VD存在一定差異。

綜上，改良2-VO法及改良MCAO/R法模擬VD均可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，大鼠海馬組織CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，因此這兩種方法均可行。其中改良2-VO模型更適用于較長時期的藥物療效研究，操作簡便，且模型穩(wěn)定。而改良MCAO/R模型是較為理想的短期藥效研究或預(yù)防藥物療效研究的造模方法之一。

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