馬婧怡，張萬鑫，陳 虹，丁 慧，劉春麗，金曉敏

(石河子大學(xué)藥學(xué)院教育部新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指腦血管病變引起腦損害后所導(dǎo)致的癡呆，以記憶、認(rèn)知功能缺損為主，同時(shí)還伴有語言、運(yùn)動(dòng)、視空間障礙以及人格障礙［1］。是目前為止唯一可以防治的癡呆，如果能夠早期發(fā)現(xiàn)并積極防治有逆轉(zhuǎn)的可能性［2］。目前VD的研究已成為醫(yī)藥學(xué)界諸多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，因而制作理想的動(dòng)物模型對(duì)探究VD的發(fā)病機(jī)制及新藥開發(fā)至關(guān)重要。既往許多學(xué)者曾采用各種腦缺血模型進(jìn)行VD模型的制作，包括最為經(jīng)典的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法，國際公認(rèn)的VD造模方法:pulinsin-四血管阻斷法，雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注法，栓塞法以及復(fù)合VD造模方法等。其中栓塞法又包括光化學(xué)誘導(dǎo)栓塞法、線栓法、微血栓顆粒造模法(血凝塊栓子栓塞法)、顱外安置小磁鐵吸附經(jīng)尾靜脈注入四氧化三鐵的方法。復(fù)合VD模型的建立包括高血壓加雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血再灌注血管性癡呆模型、高血脂加四血管阻斷法制作VD模型［3］。諸多模型都各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此，應(yīng)當(dāng)針對(duì)研究內(nèi)容及所需重點(diǎn)選擇出更為合適的建模方法。本實(shí)驗(yàn)采用兩種改良后的成熟方法制作VD模型，旨在探討比較該兩種改良方法制備的VD模型的成?？尚懦潭?。為后期進(jìn)一步深入研究防治VD的藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及儀器

水合氯醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，多聚甲醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20060714)，HM-202型十萬分之一天平(日本A＆G有限公司)，DMS-2型Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);CM3050型恒溫冰凍切片機(jī)(德國Leica公司);MIC0266型倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.2 動(dòng)物及模型制備

36只雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量250～350 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證編號(hào)SCXK(新)2011-0002。隨機(jī)分為不同時(shí)點(diǎn)永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總(改良2-VO)、改良大鼠大腦中動(dòng)脈梗死/再灌注(改良MCAO/R)、假手術(shù)組，每組12只。

1.2.1 改良2-VO模型制備

采用不同時(shí)點(diǎn)永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總(改良2-VO)的方法［4］，即采用每間隔3 d分2次永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備模型。

1.2.2 改良MCAO/R模型制備

采用左側(cè)切口、不分離翼腭動(dòng)脈等改良手段制備改良大鼠大腦中動(dòng)脈梗死模型［5］，并將栓線尾部略露出皮膚，縫線略作固定。在栓線置入2 h后再次麻醉大鼠，由露出皮膚的栓線尾部將栓線柔和緩慢地抽出，當(dāng)栓線前端膨大處遇到頸外動(dòng)脈(ECA)結(jié)扎線時(shí)會(huì)有阻力，即停止拔線，剪除栓線的殘余末端，完成改良MCAO/R模型制備。

假手術(shù)組只分離大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，但不做任何結(jié)扎及魚線插入，其余步驟縫合傷口，每日碘伏消毒。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)［4］，參照Morris實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，于術(shù)后第15天開始。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)7 d，訓(xùn)練第1天(術(shù)后第15天)讓大鼠自由游泳2 min;從第2天(術(shù)后第16天)起，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠找尋并爬上平臺(tái)時(shí)所需時(shí)間(逃避潛伏期)及運(yùn)動(dòng)軌跡，每次訓(xùn)練間隔為60 s。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期計(jì)為120 s。于訓(xùn)練第7天(術(shù)后第21天)撤除水下平臺(tái)，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)將自動(dòng)記錄其在120 s內(nèi)跨過原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)及運(yùn)動(dòng)軌跡。于術(shù)后第41天及第42天，同上述操作，再次觀察各組大鼠的逃避潛伏期及平臺(tái)穿越表現(xiàn)。

癡呆標(biāo)準(zhǔn)是以實(shí)驗(yàn)組大鼠的各時(shí)段成績的平均逃避潛伏期與假手術(shù)組逃避潛伏期的均值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比例來判定的。該值＞20%為癡呆大鼠［6］。其中，若該值＞20%≤30%為輕度癡呆，＞30%≤40%為中度癡呆，＞40%為重度癡呆。

游泳軌跡靠通過觀察動(dòng)物入水后尋找平臺(tái)來確定。隨機(jī)式的搜索軌跡往往出現(xiàn)在水迷宮大部分區(qū)域，帶有很大的盲目性;邊緣式是一種沿池壁以大幅度軌跡搜索平臺(tái)的方式，這是一種本能行為，處于較低級(jí)的認(rèn)知水平;趨向式是以曲線逐步向平臺(tái)靠攏，是一種較高級(jí)的策略，但定位不夠準(zhǔn)確;直線式為從起點(diǎn)以直線方式向平臺(tái)搜索，表明有明確的空間定位。通過記錄各組大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)期間每天第一次入水時(shí)所采用的搜索策略方式，計(jì)算出各組搜索策略方式為直線式和趨向式的大鼠個(gè)數(shù)之和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 HE染色觀察大鼠海馬組織CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)的變化

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天，大鼠ip給予10%水合氯醛(3.5 mL·kg－1)麻醉迅速斷頭取腦，去掉嗅腦、小腦及低位腦干，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分，將腦組織置于4%多聚甲醛中浸置4～6 h(4℃)。

將多聚甲醛浸置后的腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每張切片厚約5 μm，進(jìn)行HE染色在倒置熒光相差顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 改良模型大鼠逃避潛伏期表現(xiàn)

表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，兩模型組逃避潛伏期均延長(P ＜0.05，P ＜0.01)，尤以改良2-VO組的逃避潛伏期最長，改良MCAO/R組次之，而改良MCAO/R組到術(shù)后第41天與假手術(shù)組已無顯著性差異。

自術(shù)后第19天(水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第4天)起，改良MCAO/R組與改良2-VO組逃避潛伏期出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，2-VO組顯著延長，直至術(shù)后第41天，顯著性差異最為明顯(P＜0.01)。

Tab.1 Escape latency of rats in improved permanent bilateral common carotid artery occlusion(2-VO)and improved middle carebral artery occulsion(MCAO/R)models

與同組術(shù)后第41天潛伏期相比，假手術(shù)組自實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第4天起趨于平穩(wěn)(P＞0.05)，而兩模型組均與術(shù)后第41天形成顯著性差異;與術(shù)后第41天比較，術(shù)后第20天延長，改良MCAO/R組顯著延長(P ＜0.01)，改良2-VO 組次之(P ＜0.05)。

術(shù)后72 h內(nèi)，改良2-VO組中有1只大鼠，死于呼吸困難;改良MCAO/R組共有3只動(dòng)物死亡，其中1只死于呼吸困難，2只于拔栓線后死亡，假手術(shù)組大鼠無死亡。結(jié)合潛伏期數(shù)據(jù)，計(jì)算可知，術(shù)后41d時(shí)，改良2-VO組癡呆大鼠10只，其中2只為輕度癡呆，7只為中度癡呆，1只為重度癡呆。改良MCAO/R組癡呆大鼠7只，其中3只為輕度癡呆，2只為中度癡呆，2只為重度癡呆。

2.2 改良模型大鼠平臺(tái)穿越表現(xiàn)

表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，兩模型組穿越平臺(tái)次數(shù)均減少，尤以改良2-VO組最為突出。術(shù)后第21天，2-VO和MCAO/R組穿越次數(shù)顯著減少(P＜0.01)，并且2-VO組顯著低于MACO/R組(P＜0.01);術(shù)后第42天，2-VO組穿越次數(shù)依舊顯著低于假手術(shù)組，但MACO/R組已恢復(fù)至假手術(shù)組水平。

Tab.2 Number of crossing platform of rats in improved 2-VO and improved MCAO/R models

2.3 改良模型大鼠游泳軌跡表現(xiàn)

通過攝像頭記錄軌跡，各組以趨向式及直線式為搜索策略的大鼠個(gè)數(shù)之和如下表3所示。其中假手術(shù)組大鼠的游泳軌跡多為趨向式和直線式，對(duì)空間方向的辨別力較高;而改良2-VO組游泳軌跡多為邊緣式和隨機(jī)式，對(duì)空間方向辨別力很低;改良MCAO/R組從水迷宮航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第4天起，搜索策略大部分改變。通過χ2檢驗(yàn)可知，從水迷宮航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第3天(術(shù)后第18天)起，每天的χ2值分別是 7.020;8.440;9.812;10.451;13.124 和14.470，且均 P ＜0.05。

Tab.3 Total number of tendencies and linear strategies of improved 2-VO and improved MCAO/R models

2.4 改良模型大鼠海馬組織CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)變化

HE 染色后，兩模型組(圖1A，1B，1C，1D)的大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞排列紊亂稀疏，細(xì)胞形態(tài)不完整，結(jié)構(gòu)不正常，胞漿稀少，胞核與胞漿界限模糊，細(xì)胞核深染，固縮呈三角形或不規(guī)則形，核仁不明顯，并出現(xiàn)增生膠質(zhì)細(xì)胞。尤以改良2-VO組(圖1A，1B)最為嚴(yán)重，改良MCAO/R組(圖1C，1D)次之;假手術(shù)組(圖1E，1F)大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)目多，排列整齊緊密，細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，胞核與胞漿界限清晰可見，核仁明顯。

Fig.1 Morphological changes of hippocampus CA1 area of improved model rats(HE staining).A:improved 2-VO group(×200);B:improved 2-VO group(×400);C:improved MCAO/R group(×200);D:improved MCAO/R group(×400);E:sham group(×200);F:sham group(×400).Arrows show proliferative glial cells and incomplete cells.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，兩模型組學(xué)習(xí)記憶能力顯著性下降，至術(shù)后第41天改良2-VO組仍具有明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降現(xiàn)象，而改良MCAO/R組在20 d時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力確實(shí)有下降現(xiàn)象，但至術(shù)后第41天該現(xiàn)象已消失，這說明該組大鼠記憶能力顯著提高，空間探索及搜索策略結(jié)果也再次證實(shí)這一點(diǎn)。同時(shí)通過各組訓(xùn)練的每一天與同組術(shù)后第41天的潛伏期比較可看出除假手術(shù)組于訓(xùn)練后第4天起成績趨于平穩(wěn)外，兩模型組均有學(xué)習(xí)記憶能力提高的現(xiàn)象，可能是由于術(shù)后隨時(shí)間的增加大鼠自身的修復(fù)所造成。而值得注意的是，同組間的術(shù)后第21天與第42天穿越平臺(tái)次數(shù)比較中，僅有改良MCAO/R組出現(xiàn)顯著性差異，這與潛伏期所得結(jié)果不一致。分析原因可能是由于潛伏期的計(jì)算是將每只大鼠的每天上下午兩段，共8次潛伏期求平均，中間摻雜了瞬時(shí)記憶的影響。而空間探索則是在所有訓(xùn)練后第一次入水的記憶能力體現(xiàn)，更具代表性，但這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。針對(duì)目前結(jié)果而言，能夠證實(shí)的是雖然兩模型組均有自我修復(fù)過程，但改良2-VO組的程度遠(yuǎn)小于改良MCAO/R組，或者說在術(shù)后42 d內(nèi)這種修復(fù)能力對(duì)于模型成功與否的影響是很小的，而改良MCAO/R組卻因?yàn)檫@種修復(fù)而導(dǎo)致隨時(shí)間的推移，模型逐漸不成立。

以改良2-VO法導(dǎo)致癡呆的大鼠，在結(jié)扎術(shù)后42 d學(xué)習(xí)記憶能力仍無恢復(fù)趨勢，這將有利于藥物療效的長期動(dòng)態(tài)觀察，該模型是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能下降、學(xué)習(xí)記憶功能障礙，較好地模擬了人因動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈管腔狹窄等因素導(dǎo)致的VD，且手術(shù)過程簡單易行，相對(duì)穩(wěn)定。但僅結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，由于大腦動(dòng)脈環(huán)的代償作用，側(cè)支循環(huán)的建立，難以達(dá)到理想的腦缺血。

改良MCAO/R法制作的模型具有明確缺血灶［7］，成型時(shí)長短，可重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)。但隨著時(shí)間的延長，其大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有顯著性恢復(fù)。這是由于再灌注模型主要是腦的急性缺血再灌注損傷所致，沒有雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后的長期低灌注缺血的影響，雖然在造模后的20 d內(nèi)時(shí)與假手術(shù)組比較具顯著性差異，至42 d卻已無明顯差異，腦功能恢復(fù)較為明顯，該結(jié)論與以前文獻(xiàn)報(bào)道相符［8］，且大鼠栓塞性腦缺血再灌注與人群常見的VD存在一定差異。

綜上，改良2-VO法及改良MCAO/R法模擬VD均可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，大鼠海馬組織CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，因此這兩種方法均可行。其中改良2-VO模型更適用于較長時(shí)期的藥物療效研究，操作簡便，且模型穩(wěn)定。而改良MCAO/R模型是較為理想的短期藥效研究或預(yù)防藥物療效研究的造模方法之一。

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