張 樞，韓江彬，冷廣意，沙春潔，劉萬卉，

(1.煙臺大學藥學院，山東煙臺 264005;2.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室，山東煙臺 264003)

戈舍瑞林(goserelin)是人工合成的十肽，是促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)的類似物，臨床上主要適應證之一是治療對激素依賴的前列腺癌［1］。其主要作用機制是作用于下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)，用藥初期作用于垂體GnRH受體，刺激垂體釋放卵泡刺激素和黃體生成素，從而導致性腺分泌睪酮增加，血中睪酮水平升高;長期用藥后可導致GnRH受體脫敏，使黃體生成素及垂體釋放卵泡刺激素的分泌減少，進而降低血中睪酮濃度至去勢水平，抑制了前列腺癌細胞的生長，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用［2－3］。因此，戈舍瑞林需制成緩釋制劑，從而可以持續(xù)作用于受體，才能更好發(fā)揮藥效。本文通過大鼠sc給予戈舍瑞林緩釋植入劑，測定戈舍瑞林及其藥效學指標睪酮在大鼠血漿中的濃度，探討戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠體內(nèi)的藥代動力學及藥效動力學行為特征。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

醋酸戈舍瑞林對照藥(肽純度86%)，購自瑞士Bachem AG公司，2～8℃冷藏保存;睪酮對照品(98.5%)，購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;醋酸阿拉瑞林購自肽仕生物科技有限公司(上海);睪酮-d3和睪酮-13C3溶液購自美國Sigma公司;戈舍瑞林緩釋植入劑，實驗室自制;色譜純甲醇購自美國Merck公司;乙酸、甲酸購自美國Fluka公司;Oasis?HLB小柱購自美國Waters公司;EP管，購自德國Eppendorf公司。

1.2 儀器及設(shè)備

QTRAP5500質(zhì)譜儀，美國 ABSciex公司;1290高效液相系統(tǒng)，配制二元泵，美國Agilent公司;MilliQ超純水制備儀，法國Molsheim公司;Fresco21冷凍離心機，英國Thermo Fisher公司。

1.3 動物

SD大鼠24只，雄性，體質(zhì)量240～260 g，由山東綠葉制藥有限公司實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(魯)2009-0009。

1.4 給藥方法及血樣采集

將24只雄性SD大鼠隨機分成3個實驗組，分別采用每只0.3，0.6和1.2 mg 3個劑量，sc給藥。分別在給藥前(0 h)、給藥后0.5，1，6 h及1，2，3，4，9，11，13，15，18，21，28，35和42 d采血。血液置于預冷的肝素化的抗吸附EP管中，混勻后，4℃，10 000×g離心5 min，取上清液分裝至另兩個抗吸附EP管中，至－80℃保存待測。

1.5 高效液相色譜-質(zhì)譜測定條件

內(nèi)源性物質(zhì)睪酮的測定采用睪酮-d3為替代分析物［4－6］，以制備其標準曲線及質(zhì)控樣品。

色譜條件:戈舍瑞林和睪酮的色譜柱分別為ZORBAX Eclipse Plus C18柱和 ZORBAX Eclipse Plus C8柱(規(guī)格均為 Agilent，2.1 mm ×50 mm，1.8 μm，英國Stockport公司);戈舍瑞林流動相:B相為甲醇，A相為0.02%乙酸MilliQ水溶液;睪酮流動相:B相為甲醇，A相為甲酸銨1 mmol·L－1MilliQ水溶液(含0.1%甲酸);流速均為0.4 mL·min－1;柱溫分別為40℃和30℃;進樣量均為10 μL。

質(zhì)譜條件:均采用電噴霧離子化源，正離子方式檢測，掃描方式為多反應監(jiān)測;戈舍瑞林源內(nèi)參數(shù)為:離子噴射電壓:5500 V;溫度:550℃;源內(nèi)氣體1(N2)壓力:40 psi;氣體 2(N2)壓力:50 psi.;氣簾氣體(N2)壓力:30 psi;碰撞氣:8 psi;睪酮源內(nèi)參數(shù)為:離子噴射電壓:5500 V;溫度:600℃;源內(nèi)氣體1(N2)壓力:45 psi;氣體2(N2)壓力:50 psi;氣簾氣體(N2)壓力:40 psi;碰撞氣:8 psi。戈舍瑞林和內(nèi)標阿拉瑞林DP電壓為40 V;CE電壓為30 eV;睪酮，替代分析物睪酮-d3以及內(nèi)標睪酮-13C3的DP電壓均為87 V;CE電壓均為26 eV;用于定量分析的離子反應為:戈舍瑞林，635.4/607.3，內(nèi)標阿拉瑞林，584.5/249.1，睪酮 289.3/97.0，睪酮-d3，292.2/97.0，睪酮-13C3，292.2/100.2。

1.6 樣品前處理條件

1.6.1 戈舍瑞林樣品前處理條件

取100 μL 內(nèi)標溶液(阿拉瑞林 10 μg·L－1)、50 μL大鼠血漿樣品、100 μL 甲醇-水(60∶40)于1.5 mL離心管中，加入 300 μL 甲醇，渦流混合1 min，離心10 min(10 000×g)，取上層所有溶液至另一含400 μL水的2 mL離心管中，混勻，加入已經(jīng)活化好的HLB固相萃取柱，以1 mL甲醇-水(60∶40，)洗雜質(zhì)，1 mL 甲醇洗脫，洗脫液置于50℃水浴，氮氣吹干。100 μL 甲醇-水(60∶40)復溶，渦流后取10 μL進樣至液質(zhì)系統(tǒng)。

1.6.2 睪酮樣品前處理條件

取 100 μL 內(nèi)標溶液(睪酮-13C310 μg·L－1)、50 μL大鼠血漿樣品、100 μL 甲醇-水(60 ∶40)于10 mL離心管中，加入3 mL萃取液(正己烷∶二氯甲烷∶異丙醇2∶1∶0.1)，渦流混合 5 min，離心10 min(2800×g)，取上層所有溶液至另一離心管中置于 50℃ 水浴，氮氣吹干。100 μL 甲醇-水(60∶40)溶解，渦流后取10 μL進樣至液質(zhì)系統(tǒng)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用Phoenix?WinNonlin?6.3軟件，以非房室模型法處理分析戈舍瑞林的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，計算藥代動力學參數(shù)。采用SPSS17.0進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜-質(zhì)譜方法學驗證

2.1.1 專屬性

取6只大鼠空白血漿，以稀釋液分別代替標準溶液和內(nèi)標，其余項按照1.6.1項處理，得色譜圖1-A;將一定濃度的戈舍瑞林標準溶液和內(nèi)標阿拉瑞林溶液加入空白血漿樣品，依樣品前處理項操作，得色譜圖1-B。按照1.6.1項處理給藥后樣品，得色譜圖1-C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)，不干擾戈舍瑞林和內(nèi)標阿拉瑞林的測定。色譜圖2結(jié)果表明，空白血漿中的其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾睪酮的測定。

Fig.1 Typical multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of goserelin(Ⅰ)and alarelin(Ⅱ)in rat plasma.A:blank rat plasma;B:rat plasma spiked with LLOQ solution and IS;C:rat plasma sample collected at 2 d following subcutaneous injection of goserelin implant with 0.6 mg per rat.

Fig.2 Typical MRM chromatograms of testosterone-d3(Ⅰ)，testosterone-13C3(Ⅱ)，testosterone(Ⅲ)in rat plasma.A:blank rat plasma;B:rat plasma spiked with LLOQ solution and IS;C:rat plasma sample collected at 2 d following subcutaneous injection of goserelin implant with 0.6 mg per rat.

2.1.2 標準曲線

取空白血漿制成一定濃度的戈舍瑞林及睪酮-d3標準系列溶液，戈舍瑞林:0.03，0.10，0.30，1.00，3.00，10.0 和 30.0 μg·L－1;睪酮-d3:0.05，0.10，0.30，1.0，3.0，10.0 和30.0 μg·L－1。以待測物濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得戈舍瑞林標準曲線為 y=0.221x+0.00114，r=0.9992，睪 酮-d3標 準 曲 線 為y=0.0452x+0.00353，r=0.9993。

2.1.3 精密度

分別制備戈舍瑞林0.05，1.00 和24.0 μg·L－1和睪酮-d30.10，1.00 和24.0 μg·L－1的質(zhì)量控制樣品，每濃度6樣本，連續(xù)測定3 d。戈舍瑞林日內(nèi)相對標準差分別為3.07%，1.05%和6.64%;日間相對標準差分別為6.92%，3.44%和2.32%。睪酮-d3日內(nèi)相對標準差分別為2.76%，1.80%和4.38%;日間相對標準差分別為3.00%，2.70%和2.13%。

2.1.4 提取回收率及基質(zhì)效應

質(zhì)量控制樣品得到的色譜峰面積與空白基質(zhì)提取后添加相應濃度標準溶液進樣的色譜峰面積相比，計算3個濃度(每濃度4樣品)質(zhì)量控制樣品的提取回收率。戈舍瑞林的提取回收率分別為66.9%，65.4%和 67.4%，睪酮-d3的提取回收率分別為97.5%，96.9%和99.1%?？瞻谆|(zhì)提取后添加相應濃度標準溶液進樣的色譜峰面積與相應標準溶液峰面積相比，計算3個濃度(每濃度4樣品)質(zhì)量控制樣品的基質(zhì)效應。戈舍瑞林的基質(zhì)效應分別為99.0%，100.2%和98.3%，睪酮-d3的基質(zhì)效應分別為 102.5%，100.7%和 99.9%。

2.1.5 穩(wěn)定性

戈舍瑞林和睪酮的大鼠血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)，室溫放置3 h，在－80℃下放置60 d以及樣品經(jīng)處理后室溫放置10 h后的穩(wěn)定性。所有樣品的相對標準偏差絕對值均小于15%，表明大鼠血漿樣品中戈舍瑞林和睪酮在以上所有條件下均穩(wěn)定。

2.2 戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠的血藥濃度-時間曲線及其藥代動力學

大鼠皮下注射給予3個劑量戈舍瑞林緩釋植入劑后的平均血藥濃度-時間曲線見圖3。給藥初期，血藥濃度迅速上升，出現(xiàn)第一個峰值，其后緩慢釋放，在大約9～11 d達到第二個峰濃度。采用非房室模型進行擬合獲取藥代學參數(shù)，計算結(jié)果見表1。采用線性回歸對3個劑量的AUC0－t和cmax進行回歸分析，AUC0－t和 cmax線性回歸相關(guān)系數(shù)分別為r=0.942， P=0.000 ＜0.01， r=0.923，P=0.000＜0.01，結(jié)果表明線性回歸有意義。藥峰時間(Tmax)，半衰期(t1/2)，平均滯留時間(MRT)，清除率(Cl)與表觀分布容積(Vd)采用單因素方差分析顯示不同劑量組間均無顯著性差異。

Fig.3 Plasma concentration-time curves of goserelin in rats following subcutaneous injection of goserelin implant.±s，n=8.

2.4 戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠的藥效動力學

大鼠皮下注射給予3個劑量戈舍瑞林緩釋植入劑后，體內(nèi)睪酮濃度變化趨勢如圖4。各組睪酮濃度變化趨勢表現(xiàn)為:給藥初期顯著上升，4 d后降至低濃度水平，給藥后28～35 d恢復至正常水平。在每只0.3 mg水平下，大鼠給藥4 d后睪酮濃度下降至較低水平，但未完全達到理論去勢水平，給藥后21 d起，睪酮濃度即逐漸上升至正常水平。在每只0.6～1.2 mg水平下，大鼠給藥4 d后，睪酮濃度均能降低至理論去勢水平，且能夠維持至第28天。

Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of goserelin sustained-release implant in rats by subcutaneous injection

Fig.4 Plasma concentration-time curves of testosterone in rats following subcutaneous injection of goserelin implant.±s，n=8.

3 討論

與已知戈舍瑞林的測定方法［7－8］相比，采用替代分析物法制備標曲及質(zhì)控樣品測定睪酮。最低定量下限優(yōu)于文獻報道的 0.1 ng·mL－1，且專屬性好，更適用于低濃度戈舍瑞林樣品的測定。方法學數(shù)據(jù)表明，兩種方法均符合生物樣本測定［9］的要求，可用于戈舍瑞林的體內(nèi)藥代動力學及藥效動力學的分析。

戈舍瑞林緩釋植入劑在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線顯示其有2次達峰行為，初始峰值的產(chǎn)生是由于植入劑表面藥物的快速釋放，從而使得血藥濃度迅速達到較大水平，第2次達峰是由于植入劑骨架溶蝕，進一步崩解而得。每只0.3～1.2 mg劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，藥代參數(shù) AUC0－t和cmax呈線性增加，其他參數(shù) Tmax，t1/2，MRT，Cl與Vd在不同劑量組間均無顯著性差異。提示該植入劑在大鼠體內(nèi)的藥動學行為在每只0.3～1.2 mg的劑量范圍內(nèi)呈線性藥代動力學特性。

在每只0.3～1.2 mg劑量范圍內(nèi)，睪酮變化趨勢相近，隨著劑量的增加，大鼠體內(nèi)藥效學結(jié)果并未呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在每只0.3 mg劑量水平的作用下，大鼠給藥4 d后睪酮濃度雖下降至較低水平，但未完全達到理論去勢水平，提示該制劑在此濃度水平下，未能達到預期藥效水平。在每只0.6～1.2 mg劑量范圍內(nèi)，大鼠給藥4 d后，各劑量組的睪酮濃度均能降低至理論去勢水平，睪酮變化趨勢無明顯不同，維持藥效至28 d。提示該制劑在每只0.6 mg以上劑量水平的作用下，對大鼠垂體GnRH受體產(chǎn)生長時間刺激后，導致受體完全脫敏，使得睪酮濃度達到去勢水平，此時達到預期藥效作用。

根據(jù)該制劑在大鼠體內(nèi)的藥代動力學及藥效動力學研究結(jié)果表明，其藥效作用的產(chǎn)生及維持可能與戈舍瑞林的初始刺激及后續(xù)的維持濃度有關(guān)。戈舍瑞林的初始刺激達到一定強度時，一段時間后均能使大鼠垂體GnRH受體達到脫敏狀態(tài)，進而完全抑制睪酮濃度達去勢水平。后續(xù)實驗可對多種不同制劑處方的藥代動力學與藥效動力學進行研究，進一步增加樣本量，以確定兩者間的相關(guān)性。

［1］Nagy A，Schally AV.Targeting of cytotoxic luteinizing hormone-releasing hormone analogs to breast，ovarian，endometrial，and prostate cancers［J］.Biol Reprod，2005，73(5):851-859.

［2］Nicholson RI，Maynard PV.Anti-tumour activity of ICI 118630，a new potent luteinizing hormone-releasing hormone agonist［J］.Br J Cancer，1979，39(3):268-273.

［3］Kiesel LA，Rody A，Greb RR，Szilágyi A.Clinical use of GnRH analogues［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2002，56(6):677-687.

［4］Nico C，van de Merbel.Quantitative determination of endogenous compounds in biological samples using chromatographic techniques［J］.Trends in Anal Chem，2008，27(10):924-933.

［5］Li W，Cohen LH.Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix［J］.Anal Chem，2003，75(21):5854-5859.

［6］Star-Weinstock M，Williamson BL，Dey S，Pillai S，Purkayastha S.LC-ESI-MS/MS analysis of testosterone at sub-picogram levels using a novel derivatization reagent［J］.Anal Chem，2012，84(21):9310-9317.

［7］Kim MK，Lee TH，Suh JH，Eom HY，Min JW，Yeom H，et al.Development and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of goserelin in rabbit plasma［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010，878(24):2235-2242.

［8］Perren TJ，Clayton RN，Blackledge G，Bailey LC，Holder G，Lynch SS，et al.Pharmacokinetic and endocrinological parameters of a slow-release depot preparation of the GnRH analogue ICI 118630(zoladex)compared with a subcutaneous bolus and continuous subcutaneous infusion of the same drug in patients with prostatic cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1986，18(1):39-43.

［9］Guideline on Bioanalytical Method Validation，European Medicines Agency，2011［B/OL］.http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf.