劉雙雙，廖美華，尹 偉，林趙肖楠，肖桂鳳*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)成像平臺，浙江杭州 310058;2.浙江大學(xué)毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058)

神經(jīng)系統(tǒng)中所有的感覺和行為在細(xì)胞內(nèi)被編碼，通過一系列的神經(jīng)網(wǎng)路，將信息傳遞到更高的相關(guān)聯(lián)腦區(qū)，在這些腦區(qū)內(nèi)進(jìn)行信號整合后產(chǎn)生相應(yīng)的行為。作為細(xì)胞內(nèi)非常普遍的Ca2+信號傳遞系統(tǒng)，它控制著神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間信息傳遞的許多方面，測量Ca2+信號的動態(tài)變化及傳遞方式，對于研究神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能調(diào)節(jié)具有重要意義［1］。

目前測量細(xì)胞內(nèi)Ca2+的主要方法有電測量法和光測量法，電測量法是利用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測定Ca2+電流引起的細(xì)胞膜電位的變化，膜片鉗技術(shù)只能在體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者腦片上進(jìn)行測量［2］;光測量法是通過細(xì)胞特異性結(jié)合Ca2+熒光探針，利用共聚焦顯微鏡技術(shù)測定熒光強度的變化，但是共聚焦顯微鏡由于探測針孔的存在，使得成像深度只有80μm，無法實現(xiàn)活體腦內(nèi) Ca2+信號的研究［3］。因此，通過膜片鉗或者共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測Ca2+信號，只能在細(xì)胞或者在腦切片上進(jìn)行，無法深入到活體腦內(nèi)部進(jìn)行觀察，精確檢測活體動物腦內(nèi)部Ca2+動態(tài)變化一直是科學(xué)研究中的瓶頸。雙光子顯微鏡成像是近年來出現(xiàn)的新技術(shù)，具有穿透性強，光漂白光毒性小等特點，它比共聚焦顯微鏡技術(shù)更適合用來觀察厚標(biāo)本或活體組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)和離子信號的變化［4］。本研究運用雙光子顯微鏡和Ca2+熒光染料負(fù)載技術(shù)測定活體動物腦內(nèi)單個細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布影像和動作電位引起的Ca2+瞬變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

主要試劑:低熔點瓊脂糖，人工腦脊液(mmol:125 NaCl，4.5 KCl，10 glucose，26 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，2 CaCl2，1 MgSO4)，70% 消毒酒精，3% 水合氯醛，生理鹽水，雙氧水(上海生工)，二甲基亞砜(DMSO)， Pluronic F-127， Sulforhodamine 101(SR101)。Oregon Green 488 BAPTA-1(OGB-1)，SPS(mmol:150 NaCl，2.5 KCl，10 HEPES)。

實驗動物和設(shè)備:1月齡健康、清潔級BALB/c小鼠，體重18-20克(購自浙江大學(xué)實驗動物中心)。正置共聚焦雙光子顯微鏡(顯微鏡型號:Olymupus BX61W，四通道多光子熒光探測器，25x超級消復(fù)色差物鏡，F(xiàn)V1000驅(qū)動軟件)，MaiTai飛秒激光器(波長690-1020 nm連續(xù)可調(diào))，腦立體定位儀，長柄鐵塊和腦固定鐵圈(圖1)，蓋玻片，眼科彎鑷，牙科電鉆，玻璃電極絲，顯微操作儀。

圖1 腦固定器械:長柄鐵塊和腦固定圈Fig.1 Brain fixation devices:long handle iron and brain retainer ring

1.2 小鼠大腦顱骨開窗手術(shù)

1.2.1 動物麻醉 選取合適年齡的BALB/c小鼠(18-20 g)，腹腔注射3%水合氯醛，注射劑量為1.35-1.4mL/100 g。

1.2.2 開顱前準(zhǔn)備 將麻醉的老鼠用剃須刀剃去腦表面的毛發(fā)，眼科剪刀剪去頭皮，用蘸有雙氧水的棉簽擦拭腦表面以除去表面的筋膜，然后用蘸取人工腦脊液的棉簽擦拭頭骨以保持濕潤。

1.2.3 顱骨開窗手術(shù) 將麻醉的小鼠用腦立體定位儀進(jìn)行固定，用牙科電鉆小心的打磨待觀察區(qū)域的顱骨，打磨區(qū)域大約為6 mm×6 mm的圓孔，待顱骨邊緣呈半透明狀態(tài)后，用鑷子輕輕按壓顱骨，觀察到邊緣軟化即可停止，用眼科彎鑷小心地夾取顱骨邊緣將其輕輕地掀掉，此過程要求動作輕微，盡量避免出血，以免影響成像，并用人工腦脊液多次清洗窗口［5］。

1.3 染料的負(fù)載

將OGB-1溶于20%F-127-DMSO中(如2 g F-127溶于10mL DMSO)配成濃度為10 mmol/L的溶液［6］，SR101溶于 SPS中配成濃度為4 mmol/L的溶液，然 后 按 照 0.25μL OGB，0.25μL SR101 和4.50μL SPS 配成染料［7］。利用顯微操作儀以 45°角緩慢注射到腦內(nèi)，注射頻率為次/2 min，每次注射量在0.05-1μL之間，采用多點注射，選擇的注射點盡量避開血管，以減少出血，待注射完成1 h后進(jìn)行觀察［8］。

1.4 開窗區(qū)的密封和固定

將濃度為1.5%的瓊脂糖(溫度涼至室溫)滴到開窗區(qū)腦表面，上面蓋0.17 mm蓋玻片(直徑為8 mm×8 mm)，以抑制呼吸節(jié)律對成像產(chǎn)生的影響，用牙科水泥將腦固定圈封在蓋玻片外圍，確保開窗區(qū)處在中央，最后將腦固定圈固定到長柄鐵塊上，使成像時老鼠大腦始終處于水平狀態(tài)。

1.5 雙光子顯微鏡觀察

利用Olympus正置雙光子顯微鏡裝置，配有長工作距離的雙光子專用物鏡-25xW(NA:1.05)進(jìn)行成像，激發(fā)波長選用860 nm，發(fā)射的熒光通過外置探測器接收，利用雙色鏡(DM560)結(jié)合帶寬濾色片(575-640)檢測標(biāo)有SR101的星型膠質(zhì)細(xì)胞，利用雙色鏡(DM485)結(jié)合帶寬濾色片(495-540)觀察Ca2+信號。XY二維掃描時，掃描速度為2 μs/pix，圖像大小為512×512個像素;ROI時間序列掃描時，掃描速度為2 μs/pix，圖像大小為215×215個像素，連續(xù)掃描15 min，檢測Ca2+動態(tài)變化。

1.6 圖像記錄和數(shù)據(jù)處理

利用FV1000驅(qū)動軟件獲取圖像，利用 Metamorph圖像處理軟件對鈣變化水平進(jìn)行測量。鈣瞬變量化用△F/F0表示，其中△F為標(biāo)準(zhǔn)熒光強度的凈變化，F(xiàn)0為圖像背景值。

2 結(jié)果

2.1 雙光子成像系統(tǒng)的組成和成像流程

雙光子顯微鏡系統(tǒng)主要由飛秒激光器、掃描器、物鏡、探測器、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成。成像流程為:鈦-藍(lán)寶石輸出脈沖激光，經(jīng)過反射鏡反射后，到達(dá)擴束鏡，擴束鏡使光斑擴大，降低單位面積的能量，激光束被調(diào)整為強度分布均勻的平行光束，光束到達(dá)掃描振鏡(掃描振鏡分為X方向和Y方向振鏡，通過兩個方向振鏡的振動控制激光光斑在樣品焦平面上移動)，透過二色鏡，經(jīng)過物鏡匯聚到樣品上，樣品被激發(fā)后發(fā)出熒光，經(jīng)二色鏡反射到達(dá)探測器，信號被數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)收集，形成圖像［9］(圖2A)。小鼠顱骨開窗后，用牙科水泥將腦固定圈固定在開窗區(qū)外的顱骨上(圖2B)，帶有固定圈和長柄鐵塊的動物樣本放置在雙光子顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖2C)。

2.2 雙光子顯微鏡觀察腦內(nèi)鈣成像

負(fù)載熒光染料1 h后，將小鼠放置在雙光子顯微鏡載物臺上，顯微鏡目鏡下確定染料負(fù)載區(qū)域，調(diào)節(jié)焦平面選取帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞密集區(qū)，主要集中在腦表面以下200-250μm處，進(jìn)行雙光子掃描成像。被OGB-1標(biāo)記的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，被SR101標(biāo)記的星型膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出紅色熒光;熒光合成圖像中顯示黃色的為星型膠質(zhì)細(xì)胞，顯示綠色的為神經(jīng)元(圖3)，由圖像可見:神經(jīng)元豐富且胞體清晰，圖像分辨率高，根據(jù)發(fā)射的熒光不同，能明顯區(qū)分神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。

圖2 在體雙光子成像系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic diagram of In vivo two photon imaging

圖3 活體腦內(nèi)神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞鈣成像Fig.3 In vivo Ca2+imaging in Neuron and Astrocyte

2.3 神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+動態(tài)變化

為了捕捉到Ca2+的快速變化，通過 ROI時間序列掃描實時檢測15 min內(nèi)Ca2+動態(tài)變化，掃描速度設(shè)置為2 μs/pix，圖像大小為256×256個像素，通過圖像處理軟件Metamorph將熒光強度的變化轉(zhuǎn)化成波形圖。神經(jīng)元內(nèi)鈣離子通過動作電位引起自發(fā)Ca2+瞬變，通過測量神經(jīng)元胞體平均像素強度量化熒光信號，神經(jīng)元出現(xiàn)的每一個波峰代表一次鈣瞬變，即動作電位。星型膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+波形時程較長，幅度較緩，無快速上升相出現(xiàn)(圖4)。

3 討論

圖4 活體小鼠皮層神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變Fig.4 Ca2+transents in cortical neuron and astrocyte of an mouse

雙光子顯微鏡又稱非線性、多光子激光掃描顯微鏡，是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。其基本原理是:在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的［10］。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫，使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度最高，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)勢:1)長波長的光比短波長的光受散射影響較小更易穿透標(biāo)本;2)焦平面外的熒光分子不被激發(fā)使較多的激發(fā)光可以到達(dá)焦平面，使激發(fā)光可以穿透更深的標(biāo)本;3)長波長的近紅外光比短波長的光對細(xì)胞毒性小;4)使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性［11］。利用雙光子顯微鏡對活體動物體內(nèi)Ca2+信號檢測，為神經(jīng)元-膠質(zhì)環(huán)路研究提供了新的技術(shù)方法。

與共聚焦顯微鏡具備多種類型激光器不同，雙光子顯微鏡配備單一的飛秒激光器，在進(jìn)行多色成像時，多種染料利用同一波長的激發(fā)光激發(fā)，容易產(chǎn)生串色現(xiàn)象，為了減少OGB-1和SR101這兩種染料的相互串色，在不改變激光能量和探測器電壓值的前提下，將脈沖激光從700 nm～900 nm連續(xù)測試，波段測試步徑為10 nm，探索合適的雙光子激發(fā)波長，通過實驗發(fā)現(xiàn)在860 nm處既能有效激發(fā)出兩種染料的熒光，又能減少串色。

本實驗采用高親和性染料對小鼠腦內(nèi)Ca2+進(jìn)行雙光子成像觀察，OGB-1為Ca2+熒光指示劑，為膜通透性染料，進(jìn)入細(xì)胞后，被酯酶水解，變成膜不通透性，滯留在細(xì)胞內(nèi)，雙光子成像時熒光強度的變化能反應(yīng)Ca2+信號的強弱［12］。SR101為星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，將兩種試劑按照合適的比例混合后，利用多小區(qū)丸劑加載技術(shù)(multi-cell bolus loading technique)負(fù)載到腦內(nèi)，根據(jù)發(fā)射的熒光波長不同，可區(qū)分神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞［8］。

為了得到高分辨率的圖像，記錄神經(jīng)元快速的放電活動，實驗過程需注意以下幾點:(1)樣本制作過程中，要求動作細(xì)致，盡量避免出血，特別在用電鉆打磨顱骨過程中，待顱骨邊緣磨薄后，用鑷子輕輕掀起顱骨，若有出血現(xiàn)象會降低圖像信噪比，影響成像效果。(2)染料配制過程中，為了防止染料沉淀物堵塞玻璃電極絲，需要用0.45μm過濾器對染料進(jìn)行過濾。(3)Ca2+染料負(fù)載時，控制負(fù)載深度在200μm-300μm處，既能標(biāo)記較多神經(jīng)元又可獲取高質(zhì)量的圖像，染料如負(fù)載過深，由于光散射的影響，探測到的Ca2+信號較弱，如負(fù)載過淺，由于大腦表層以膠質(zhì)細(xì)胞為主，則標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量較少。(4)通過ROI方式進(jìn)行時間序列掃描時，應(yīng)控制ROI區(qū)域大小，使獲得每楨圖像的時間在200 ms內(nèi)，以捕捉到Ca2+信號快速變化。

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