羅奇志，鄔力祥，文 芳，韓 仰，黃柏勝*

(中南大學湘雅醫(yī)學院 a.免疫學系;b.生理學系，湖南 長沙 410078)

膠質(zhì)瘤起源于膠質(zhì)細胞或其前體細胞，是臨床上常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，大約占顱內(nèi)腫瘤的40%-50%，病人確診后5年存活率少于3%［1，2］。膠質(zhì)瘤具有高侵襲性，與鄰近正常腦組織無明顯分界，是構(gòu)成其難治性的重要因素，導(dǎo)致手術(shù)治療難以根除，常易復(fù)發(fā)、死亡率高。目前膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療手段如手術(shù)切除、放療、化療效果并不滿意［3］，經(jīng)治療后的患者的中位生存期僅有14個月左右［4］。因此，如何延長膠質(zhì)瘤患者的存活期是我們目前正面臨的緊迫問題。轉(zhuǎn)錄因子PAX6是進化上高度保守的PAX(Paired box)家族成員之一，與腦的發(fā)育有關(guān)，在腦中持久表達［5］。然而與鄰近的正常組織相比，膠質(zhì)瘤中PAX6的表達水平明顯降低［6］，過表達PAX6可抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和侵襲［7，8］。近年來的研究使microRNA(miRNAs)已經(jīng)迅速發(fā)展成為癌癥和其它疾病的重要的潛在分子標志［9］。miRNAs屬于一類18-22個堿基的、非編碼的單鏈RNAs，它可以通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslation region，3'-UTR)特異性結(jié)合，引起靶基因mRNA降解和/或翻譯受阻，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達［10，11］。因此深入探討膠質(zhì)瘤中 PAX6表達下調(diào)的具體機制，有望為膠質(zhì)瘤的治療提供新思路。在本研究中，我們采用生物信息學軟件在線預(yù)測可能與PAX63'-UTR相互作用的miRNAs，構(gòu)建野生型和突變型PAX6基因3'-UTR雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒，驗證miR-223與PAX63'-UTR的靶向關(guān)系，為進一步研究miR-223對PAX6的調(diào)控作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，psiCHECKTM-2載體(Auragene公司)，Not I、Xho I內(nèi)切酶和 T4連接酶(Fermentans公司)，DH5α感受態(tài)細胞(Auragene公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，質(zhì)粒小提試劑盒(康為世紀公司)，DNA回收試劑盒(Omega公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司)，1 kb DNA ladder、DS2000 DNA ladder(康為世紀公司)，miR-223 mimics(廣州復(fù)能公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤細胞系(U251)購自中國科學院上海細胞生物學研究所，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 miRNA 靶點預(yù)測

應(yīng)用 www.targetscan.org和 www.microrna.org在線生物信息學預(yù)測軟件對人PAX63'-UTR可能作用的miRNAs進行預(yù)測分析，尋找調(diào)控PAX6的可能的miRNAs。

1.2.3 PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2、PAX6 Mut3'-UTR-psiCHECKTM-2雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)NCBI中人PAX63'-UTR基因序列(NM_001604)，采用Primer5.0軟件進行引物設(shè)計，上游、下游引物5'端分別加入 Xho I、Not I酶切位點序列(下劃線部分)，預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為455 bp，引物序列如下:

以慢性粒細胞白血病K562細胞cDNA為模版，用以上引物擴增目的基因片段，將PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，再用Xho I和Not I對回收的目的基因片段和psiCHECKTM-2雙熒光素酶報告基因空載體同時進行過夜酶切16 h，將酶切產(chǎn)物電泳并回收酶切后的目的基因片段和psiCHECKTM-2雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒，T4連接酶連接回收的目的基因片段和psiCHECKTM-2載體，室溫連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，搖菌。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒的鑒定

1.2.4.1 菌落PCR鑒定 以所構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)的引物擴增目的片段的全長或部分。挑取平板上長出的單個菌落重懸于10 μL LB培養(yǎng)液中，從中取1 μL做模板進行菌落PCR鑒定，擴增引物序列及擴增產(chǎn)物大小同1.2.3。

1.2.4.2 雙酶切鑒定 用Xho I和Not I內(nèi)切酶對抽提重組質(zhì)粒進行雙酶切，切出兩條帶，一條是原載體psiCHECKTM-2，另一條為目的片段，與用相同引物從基因組中擴增出來的片段大小相同。

1.2.4.3 測序鑒定 測序可以識別出擴增過程中出現(xiàn)的堿基突變等情況，將菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定均正確的樣品送武漢華大基因進行雙向測序。

1.2.5 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染U251細胞

取對數(shù)生長期的U251細胞，在轉(zhuǎn)染前1天按照每孔5×105個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染時細胞密度大約為60%～70%;利用脂質(zhì)體lipofectamine2000進行共轉(zhuǎn)染miR-223 mimics和雙熒光素酶重組質(zhì)粒至U251細胞。按照以下實驗分組進行:①轉(zhuǎn)染PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2雙熒光素酶質(zhì)粒組(NC組);②共轉(zhuǎn)染PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2+miR-223 mimics組(PAX63'-UTR+miR-223);③轉(zhuǎn)染PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2雙熒光素酶質(zhì)粒組(NC組);④共轉(zhuǎn)染 PAX6 Mut 3'-UTR-psi-CHECKTM-2+miR-223 mimics組(PAX6 Mut 3'-UTR+miR-223)。每組實驗樣本3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后進行熒光素酶活性檢測。

1.2.6 熒光素酶報告基因活性檢測

應(yīng)用Promega公司雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞的熒光素酶報告基因活性。按試劑盒說明書操作如下，棄原細胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗待轉(zhuǎn)染的細胞兩次，每孔細胞加入20 μL 1×PLB裂解液裂解細胞，室溫振蕩裂解細胞15分鐘，收集細胞裂解液。加入100 μL LARⅡ工作液，快速混勻后，檢測螢火蟲熒光素酶活性值;然后加入100 μL Stop溶液，快速混勻后，置入發(fā)光檢測儀中，檢測海腎熒光素酶活性值;取測定的3個復(fù)孔的平均值計算相對熒光值。按照以下公式計算:相對熒光值=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PAX6 mRNA靶向miRNAs的預(yù)測結(jié)果

通過生物信息學的預(yù)測軟件，分析miR-223與其靶基因的結(jié)合情況，兩個在線軟件預(yù)測結(jié)果均顯示PAX6的3'-UTR區(qū)有7個堿基(AACUGAC)能夠與miR-223的“種子區(qū)”的堿基(UUGACUG)存在互補配對，該兩個網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果均提示PAX6可能是miR-223的靶基因。(圖1)。

圖1 PAX6基因3'-UTR的miRNAs靶點預(yù)測Fig.1 Prediction result of miRNAs targeting PAX6 gene 3'-UTR

2.2 PAX63'-UTR 及 PAX6 Mut 3'-UTR 的 PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳

以K562細胞cDNA為模板，PCR擴增PAX63'-UTR和PAX6 Mut 3'-UTR，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠后，結(jié)果可見擴增產(chǎn)物條帶大小為455 bp，與預(yù)期的擴增產(chǎn)物大小一致(圖2)。

2.3 psiCHECKTM-2雙熒光素酶載體雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳

psiCHECKTM-2載體購自Auragene公司，分別用Not I/Xho I雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如下(圖3)。

2.4 雙熒光素酶重組質(zhì)粒的鑒定

2.4.1 菌落PCR 鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，1-6號孔為PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2 克隆檢菌，其中 1、2、3、4、6 號孔為陽性，擴增條帶大小與預(yù)計產(chǎn)物455 bp一致，5號孔為陰性;7-14號孔為PAX6 Mut3'-UTR-psi-CHECKTM-2克隆檢菌，其中 7、9、10、13 號孔為陽性，擴增條帶大小亦與預(yù)計產(chǎn)物455 bp一致，8、11、12、14號孔為陰性(圖4)。

圖2 PAX63'-UTR和PAX6 Mut 3'-UTR的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of PAX63'-UTR and PAX6 Mut 3'-UTR

圖3 psiCHECKTM-2載體的雙酶切鑒定Fig.3 Double-enzyme digestion of psiCHECKTM-2 vector

圖4 雙熒光素酶重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定Fig.4 Identifying dual luciferase recombinant plasmid by colony PCR

2.4.2 雙酶切鑒定

雙熒光素酶重組質(zhì)粒經(jīng)Not I/Xho I雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳圖可見有兩條條帶，由圖5可見，其中一條條帶與psiCHECKTM-2空載體大小6273 bp一致，另一條條帶為插入的目的片段，大小與455 bp相同，說明雙熒光素酶重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4.3 重組質(zhì)粒的測序鑒定

將菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定均正確的雙熒光素酶重組質(zhì)粒送武漢華大基因公司進行測序，測序結(jié)果證實插入片段是PAX63'-UTR、PAX6 Mut3'-UTR序列，且與模板序列比對無點突變，質(zhì)粒部分測序峰圖如下(圖6)。

2.5 miR-223與PAX63'-UTR靶向關(guān)系分析

在生物信息學軟件在線預(yù)測PAX6為miR-223靶基因的基礎(chǔ)上，為了進一步驗證miR-223是否能夠靶向結(jié)合PAX63'-UTR，我們將PAX63'-UTR-psi-CHECKTM-2質(zhì)粒和PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2質(zhì)粒與miR-223 mimics分別共轉(zhuǎn)染至U251細胞，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞的熒光素酶報告基因活性，檢測結(jié)果如圖7所示。與單一的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，miR-223 mimics能明顯降低PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2的熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果提示miR-223與PAX6基因3'-UTR區(qū)存在靶向作用關(guān)系，它能夠靶向負性調(diào)節(jié)PAX63'-UTR。

圖5 雙熒光素酶重組質(zhì)粒經(jīng)Not I/Xho I雙酶切鑒定Fig.5 Enzyme digestion of the dual luciferase recombinant plasmid

圖6 雙熒光素酶重組質(zhì)粒的序列測定Fig.6 The sequencing map of dual luciferase recombinant plasmid

3 討論

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，因它具有獨特的侵襲性而難以治療，因此尋找腦膠質(zhì)瘤新的治療靶點具有重要意義。研究報道，與鄰近的正常組織相比，膠質(zhì)瘤中PAX6的表達水平明顯降低［6］。目前認為，PAX6在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是一種抑制性調(diào)控因素，過表達PAX6能抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和侵襲［7，8］。因此深入探討膠質(zhì)瘤中PAX6表達下調(diào)的確切機制，有望為明確膠質(zhì)瘤的侵襲性指明新思路。

圖7 膠質(zhì)瘤U251細胞中雙熒光素酶活性分析Fig.7 Analysis of the reporter activities in U251 cells

miRNAs屬于一類小的、非編碼的單鏈RNA，它可以通過與靶基因mRNA的3'-UTR結(jié)合，引起靶基因mRNA降解或翻譯受阻，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白的表達。miRNAs具有多種生物學作用，它作為抑癌基因還是致癌基因取決于它們相關(guān)靶基因的功能。隨著人們對miRNAs的基本特征、生物學功能等的進一步了解，發(fā)現(xiàn)miRNAs能夠通過調(diào)節(jié)下游基因的表達和功能從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動［9］。另外一些特異性的miRNAs在膠質(zhì)瘤中的表達水平異?；虬l(fā)生突變，且影響膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移，提示miRNAs的異常表達與膠質(zhì)瘤密切相關(guān)，很多miRNAs的靶基因就是抑癌基因或致癌基因。目前已經(jīng)將miRNAs作為膠質(zhì)瘤臨床診斷的生物學標志以及最有潛力的治療靶點之一［12，13］。相關(guān)的研究也證實了一些 miRNAs在膠質(zhì)瘤形成、生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面起到重要的調(diào)控作用。作為癌癥重要調(diào)節(jié)因子的miRNAs給我們帶來了治療膠質(zhì)瘤的新希望［1，14，15］。

有研究報道m(xù)iRNAs作為腫瘤抑制基因或致癌基因取決于它作用的靶基因的功能，如miR-223作為致癌基因或腫瘤抑制基因與癌癥的不同類型有關(guān)，在不同類型的癌癥或腫瘤細胞中miR-223靶向不同或相同的基因而呈現(xiàn)不同的作用［16-20］。例如，它可以通過靶向Hsp90B1而抑制骨肉瘤的生長［16］;miR-223在結(jié)腸直腸癌HCT116細胞、宮頸癌Hela細胞和肝癌HuH7細胞中低表達，而過表達miR-223可以通過靶向FOXO1而抑制上述三種癌細胞的增殖［17］。但miR-223在胃癌細胞中高表達，它作為致癌基因通過靶向結(jié)合腫瘤生長抑制基因EPB41L3［18］的3'-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)靶基因的表達，與癌細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)，或者抑制FBXW7/hCdc4［19］的表達而促進胃癌細胞的增殖和侵襲。在乳腺癌細胞中，miR-223通過Mef2c-b-catenin信號通路，提高癌細胞的侵襲能力［21］。另外在胃癌中miR-223靶向抑制stathmin1的表達而發(fā)揮致癌作用［20］，然而在膠質(zhì)瘤中miR-223的生物學功能目前還不清楚。此外，與PAX6相關(guān)的miRNAs的報道非常少見［22］，在膠質(zhì)瘤中，靶向調(diào)節(jié)PAX6的miRNAs尚需要進一步實驗證實。

隨著對miRNAs研究的不斷深入，miRNAs靶基因預(yù)測的生物信息學軟件迅速興起，研究者根據(jù)已知miRNAs及其靶基因mRNA之間的某些序列特征制定不同運算規(guī)則，開發(fā)出多種軟件進行miRNAs靶基因的預(yù)測。在本研究中，我們選用了兩個比較權(quán)威的在線軟件 Targetscan 5.1和 Microrna預(yù)測了PAX6基因3'-UTR可能的靶向miRNAs。本實驗中，生物信息學軟件在線預(yù)測結(jié)果顯示，miR-223與PAX6基因3'-UTR能夠不完全互補結(jié)合，可能對PAX6基因具有靶向調(diào)節(jié)作用。據(jù)此，我們構(gòu)建了野生型PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2和突變型PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2雙熒光素酶重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒分別與miR-223 mimics共轉(zhuǎn)染U251細胞，實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2重組質(zhì)粒和miR-223 mimics的細胞樣本中，熒光素酶活性強度相比其它組顯著下降，miR-223 mimics顯著地抑制了野生型PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2熒光素酶報告基因的活性，miR-223能識別PAX63'-UTR序列而使報告基因熒光素酶活性下降(P＜0.05)，說明miR-223與PAX6基因3'-UTR區(qū)存在靶向作用關(guān)系;該實驗初步證實了miR-223能夠與PAX63'-UTR靶向結(jié)合，并能夠負性調(diào)節(jié)PAX6的表達，但仍需要進一步在mRNA和蛋白水平給予驗證。

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